Микробиологическое исследование овощей лабораторная работа. Стерилизация насыщенным паром под давлением. Техника взятия культуры для препаратов

Методические рекомендации

по выполнению практических работ

для профессии:

19.01.17 Повар. Кондитер

Разработчик:

Веретенникова О.М. преподаватель

Валуйки, 2016

Пояснительная записка

Настоящие методические указания для выполнения практических работ по дисциплине « основы микробиологии, санитарии и гигиены в пищевом производстве » были разработаны на основе Федерального государственного образовательного стандарта (далее – ФГОС) по профессии:

19.01.17 Повар. Кондитер

Методические указания для выполнения практических работ предназначены для студентов первого курса Выполнение практических и лабораторных работ направлено на решение следующих задач:

повысить осознание и прочность усвоения знаний;

развивать умения анализировать, сравнивать изучаемые объекты, проводить исследование, составлять таблицы, схемы, кластеры, делать выводы;

развивать у обучающихся логическое мышление, познавательные способности, самостоятельность;

научить использовать полученные знания и умения в жизни.

При изучении, закреплении материала используются следующие типы самостоятельных работ:

Работа с текстом учебника.

Работа с презентацией.

Работа с изучаемым объектом.

Работа с таблицей.

Работа по составлению кластера, схемы.

Работа с готовыми микропрепаратами. Приготовление микропрепаратов.

Структура методических указаний:

1. тема
2. цель работы
3. оборудование для выполнения работ
4. ход работы
5. контроль и актуализация знаний студентов, необходимых для выполнения работы
6. условия выполнения работы

Каждое практическая и лабораторная работа должна быть оформлена в тетради для практических работ в соответствии с рекомендациями . (Приложение 1)

Контроль результатов выполненных работ осуществляется на основании письменного отчета и результатов наблюдения за обучающимся в ходе выполнения работы в соответствии с критериями оценок за выполнение практической работы.

Перечень практических работ

Практическая работа №1

Устройство микроскопа и правила работы с ним.

Практическая работа №2 Изучение под микроскопом морфологии дрожжей и плесени

Практическая работа № 3 Схемы строения клеток бактерий, дрожжей, грибов.

Практическая работа № 4-5

Практическая работа № 6 Схемы приготовления дезинфицирующих растворов и их хранение

Практические задание, направленные на проверку умений обучающихся применять теоретические знания по дисциплине на практике

Практическая работа №1 УСТРОЙСТВО МИКРОСКОПА И ПРАВИЛА РАБОТЫ С НИМ.

Цель работы: Изучить устройство светового биологического микроскопа и освоить правила работы с ним.

Оборудование, материалы: Микроскоп; готовые микропрепараты

Микроскоп (от греч. micros – малый и scopio – смотрю) – это оптический прибор, состоящий из трех основных частей: механической, оптической и осветительной.

Схема светового биологического микроскопа представлена на рис. 1.

Механическая часть или штатив состоит из ножки, основания, тубусодержателя, предметного столика, монокулярной насадки (тубуса), револьверного устройства, рукоятки грубой фокусировки (макрометрического винта), рукоятки тонкой фокусировки (микрометрического винта).

Тубус – зрительная труба микроскопа. В верхнее отверстие тубуса свободно вставляется окуляр, на нижнем конце тубуса находится вращающееся вокруг своей оси револьверное устройство (револьвер), в которое ввинчиваются объективы. Вращая револьвер, можно быстро сменить объективы во время работы с микроскопом, подводя любой объектив под тубус. Объектив должен быть центрирован, т.е. установлен на оптическую ось микроскопа. Для этого револьвер поворачивают вокруг своей оси до появления щелчка.

Предметный столик служит для размещения на нем изучаемого препарата. Препарат закрепляют на столике зажимами (клеммами). В центре предметного столика находится отверстие для прохождения лучей света и освещения препарата. В некоторых конструкциях микроскопа предметный столик может передвигаться с помощью винтов, расположенных по периферии предметного столика. Это дает возможность рассмотреть препарат в различных полях зрения.

1 – окуляр

2 – монокулярная насадка

(тубус)

3 – револьверное устройство

4 - объектив

5 – предметный столик

6 - конденсор

7 – корпус коллекторной линзы

8 – патрон с лампой

9 - шарнир

10 – рукоятка перемещения кронштейна конденсора

11 – рукоятка тонкой фокусировки (микрометрический винт)

12 – рукоятка грубой фокусировки (макрометрический винт)

13 - тубусодержатель

14 – винт для крепления насадки

Рис. 1 Схема устройства светового биологического микроскопа

Рукоятки грубой и тонкой фокусировки (макро- и микровинты) служат для перемещения тубуса вверх и вниз, что позволяет установить его на необходимом расстоянии от препарата. При вращении винтов по часовой стрелке тубус опускается, а при вращении против часовой стрелки – поднимается. При вращении макрометрического винта объектив ориентировочно устанавливается на фокус, т.е. на то расстояние от препарата, при котором он делается видимым. Оборот макровинта позволяет переместить тубус на 20 мм. Микрометрический винт служит для точной установки на фокус. Полный оборот его перемещает тубус на 0,1 мм. С микровинтом следует обращаться очень осторожно: допустимо вращение микровинта не более чем на 180 0 С в ту или иную сторону.

Оптическая часть является наиболее ценной частью микроскопа. Она состоит из объективов и окуляра.

Окуляр (от лат. oculus – глаз) состоит их двух плосковыпуклых линз, заключенных в общую металлическую оправу. Верхняя линза – глазная (увеличивающая), нижняя – собирающая. Расстояние между линзами равно полусумме их фокусного расстояния. У окуляров с большим увеличением фокус короче, поэтому меньше и длина окуляра. Между линзами имеется диафрагма, ограничивающая поле зрения и задерживающая краевые лучи света. Отечественные микроскопы снабжены тремя сменными окулярами, увеличение которых указано на корпусе окуляра (х7; х10; х15).

Объективы ввинчиваются в гнезда револьверного устройства и состоят из системы линз, заключенных в металлическую оправу. Передняя (фронтальная) линза объектива является самой маленькой и единственной, дающей увеличение. Остальные линзы в объективе только исправляют недостатки полученного изображения (явления сферической и хроматической аберрации) и называются коррекционными.

В гнезда револьверного устройства ввинчиваются четыре объектива, увеличение которых указано на корпусе объектива (х8; х20; х40; х90 или 100). Каждый объектив характеризуется своим фокусным расстоянием (расстоянием между предметным стеклом и фронтальной линзой): объектив х8 имеет фокусное расстояние около 9 мм, объектив х40 – 0,65 мм, объектив х90 – 0,15 мм.

Осветительная часть микроскопа состоит из двухлинзового конденсора, ирис-диафрагмы и патрона с низковольтной лампочкой накаливания, питающейся через понижающий трансформатор от сети напряжения 120…220 В.

Конденсор служит для лучшего освещения препарата. Он собирает световые лучи в пучок и направляет их через отверстие предметного столика на препарат. С помощью рукоятки для перемещения кронштейна конденсора его можно перемещать вверх и вниз, благодаря чему меняется угол сходимости лучей и, следовательно, степень освещения объекта. Чем выше положение конденсора, тем лучше освещен препарат.

Ирис-диафрагма располагается под конденсором и служит для регулировки потока света, поступающего в конденсор. Она состоит из металлических серповидных пластинок. Расширить или сузить отверстие диафрагмы можно с помощью специального рычажка. При вращении его по часовой стрелке отверстие ирис-диафрагмы увеличивается и, следовательно, увеличивается степень освещения объекта.

При работе с иммерсионными объективами степень освещения препарата должна быть максимальной, поэтому шторку ирис-диафрагмы открывают, а конденсор поднимают в крайнее верхнее положение.

При работе с сухими объективами, как правило, рассматривают неокрашенные объекты. Для достижения контрастности конденсор опускают вниз, а отверстие ирис-диафрагмы уменьшают.

Правила работы с микроскопом

На рабочем столе микроскоп ставят тубусодержателем к себе на расстоянии 3…5 см от края стола;

Включают микроскоп в сеть и устанавливают правильное освещение

На предметный столик помещают исследуемый препарат и закрепляют его клеммами;

Под тубус помещают нужный объектив и с помощью макро и микровинтов устанавливают фокусное расстояние. Так, при работе с иммерсионными объективами на препарат предварительно наносят каплю иммерсионного масла и осторожно опускают тубусодержатель макровинтом до соприкосновения со стеклом. Затем, внимательно смотря в окуляр, очень медленно поднимают тубусодержатель, вращая его против часовой стрелки, до тех пор, пока не увидят изображение. Точную наводку объектива на фокус производят микрометрическим винтом. При работе с сухими объективами препарат вначале рассматривают с объективом х8. Поднимая с помощью макровинта тубусодержатель и внимательно смотря в окуляр, устанавливают фокусное расстояние (около 9 мм) и добиваются четкости изображения, используя микрометрический винт. Далее, двигая предметный столик или предметное стекло, устанавливают в центр поля тот участок препарата, в котором лучше всего виден изучаемый объект. Затем, вращая револьверное устройство вокруг своей оси, под тубус помещают объектив на х20 или х40. При этом под тубус не должен попасть объектив х90. В револьверном устройстве объективы располагаются таким образом, что если найдено изображение с объективом х8, то при рассмотрении препарата с объективами большего увеличения нужно слегка подрегулировать четкость изображения с помощью макро- и микрометрических винтов;

Во время микроскопирования необходимо держать оба глаза открытыми и пользоваться ими попеременно;

После окончания работы следует убрать препарат с предметного столика, опустить вниз конденсор, поставить под тубус объектив х8, удалить мягкой тканью или марлей, смоченной в спирте, иммерсионное масло с фронтальной линзы объектива х90, под объектив положить марлевую салфетку, опустить тубусодержатель.

Каково устройство биологического микроскопа?

Из каких частей и механизмов состоит механическая часть микроскопа?

Что составляет оптическую систему микроскопа?

Что входит в состав осветительной системы микроскопа?

Как следует настроить осветительную систему при работе с иммерсионным объективом?

Перечислить основные правила работы с микроскопом.

Условия выполнения задания
1. Место (время) выполнения задания
Кабинет биологии

Практическая работа №2 Изучение под микроскопом морфологии дрожжей и плесени.

Цель работы : Ознакомиться с морфологическими особенностями грибов и дрожжей, встречающихся при производстве пищевых продуктов. Освоить технику микроскопического исследования грибов и дрожжей в препаратах «раздавленная капля».

Оборудование, материалы: Микроскоп; препаровальные иглы,предметные и покровные стекла; фильтровальная бумага; спиртовка; культуры грибов родов Mucor , Aspergillus , Penicillium , Alternaria ; чистая культура дрожжей Saccharomyces cerevisiae .

1. КРАТКИЕ ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

1. 1. Морфология и культуральные признаки микроскопических грибов

Вегетативное тело грибов называется мицелием . Мицелий состоит из множества переплетающихся нитей-трубочек, называемых гифами . Диаметр гифов, колеблется от 5 до 50 мкм. В зависимости от строения мицелия грибы делятся на высшие и низшие. У высших грибов гифы разделены перегородками (септами) в центре которых имеется большая пора. Они растут и при этом происходят деления ядер, но не происходит клеточных делений. Таким образом, вегетативное тело гриба представляет собой одну большую многоядерную клетку. Все микроскопические грибы могут размножаться вегетативно кусочком мицелия.

При бесполом размножении у фикомицетов образуются спорангиеносцы , а у аскомицетов – конидиеносцы .

Культуральные признаки микроскопических грибов

Колонии микроскопических грибов по размерам во много раз превосходят колонии одноклеточных организмов (бактерий, грибов) и нередко разрастаются по всей поверхности питательной среды в чашках Петри. Консистенция грибных колоний различная. Чаще образуются войлокообразные и кожистые колонии, реже крошковатые. Поверхность колоний может быть пушистой, как вата, бархатистой, мучнистой, паутинообразной, нитевидной, кожистой или гладкой. При росте на плотных и жидких средах часть гифов врастает в питательную среду, образуя субстратный мицелий, а другая часть гифов образует воздушный мицелий в виде пушистого налета, видимого невооруженным глазом. Мицелий может быть также бесцветным (белым, сероватым) или окрашенным (черным, бурым, зеленым, желтым и т.д.). Пигментирован только плодоносящий мицелий.

Характеристика микроскопических грибов различных классов

Морфологические особенности грибов различных классов представлены на рис. 5.

Род Mucor . Они могут размножаться бесполым и половым путем с образованием спорангиеносцев (рис. 5). Снаружи спорангий покрыт тонкими шипами из кристаллов щавелевокислого кальция. При созревании спорангий разрывается, спорангиеспоры высвобождаются и разносятся воздушными потоками. На спорангиеносце после освобождения спорангия от спор остается колонка, а в нижней ее части – воротник. Цвет мицелия мукоровых грибов вначале белый, затем серовато-оливковый, вид – войлокоподобный .

а

б

в

г

Рис. 5 Морфологические особенности грибов различных классов:

а - Mucor; б - Penicillium; в - Aspergillus; г - Alternaria

Мукоровые грибы растут на поверхности влажного зерна, солода, корнеплодов, на пищевых продуктах, на стенах сырых помещений в виде сероватого пушистого налета. Mucor nigricans является возбудителем кагатной гнили сахарной свеклы. Многие мукоровые грибы используются в промышленности для производства различных органических кислот и спирта (грибы видов Mucor javanicus , Mucor racemosus ), ферментных препаратов, каротиноидов, стероидов.

Представители родов Aspergillus и Penicillium относятся к классу аскомицетов, который объединяет высшие микроскопические совершенные грибы. При бесполом размножении с помощью спор эти грибы образуют конидиеносцы (рис. 5). Аспергиллы и пенициллы относятся к плодосумчатым грибам. Это значит что при половом размножении у них на специальных плодовых телах образуются аски (сумки), в которых находятся 8 аскоспор.

К роду Penicillium относится около половины всех плесневых грибов. Они широко распространены в почве, в воздухе плохо проветриваемых помещений и вызывают порчу различных продуктов и материалов. Этот гриб имеет ветвящийся септированный мицелий (диаметр гифов – 2…3 мкм) и септированные конидиеносцы (напоминают кисточки), которые на конце разветвляются в виде отростков – стеригм. От них отходят конидии, состоящие из цепочек спор. В зависимости от вида конидии могут быть разного цвета (белые, зеленые и др.). Многие пенициллы используются в промышленности для получения различных ценных продуктов. Среди выделенных штаммов этого рода 25 % обладают антибиотической активностью, а такие виды как Penicillium notatum , Penicillium chrysogenum используются как продуценты пенициллина. Некоторые виды пенициллов используются как продуценты ферментов и липидов. В производстве мягких сыров рокфор и камамбер используются благородные плесени Penicillium roqueforti и Penicillium camamberti .

Грибы рода Aspergillus насчитывают более 200 видов. Эти грибы имеют хорошо развитый ветвящийся мицелий с многочисленными септами. Конидиеносцы несептированы, верхние их концы грушевидно или шаровидно расширены в виде небольшой головки. На головке располагаются кеглеобразные стеригмы с цепочками конидий, которые напоминают струйки воды, выливающиеся из лейки. Отсюда возникло название «леечная плесень» (aspergere по латыни – поливать, опрыскивать). Конидии аспергиллов при созревании приобретают различную окраску, что наряду с другими признаками определяет их видовую принадлежность.

Так же как и пенициллы, представители рода Aspergillus широко распространены в природе и играют важную роль в минерализации органических веществ. Они вызывают плесневение многих пищевых продуктов. Эти грибы являются продуцентами многих ценных веществ и широко используются в промышленности. Так, Aspergillus niger , применяют в промышленности для производства лимонной кислоты; Aspergillus terreus – итаконовой кислоты Aspergillus flavus и Aspergillus terricola образуют наиболее активный комплекс протеолитических ферментов; Aspergillus oryzae и Aspergillus awamori являются лучшими продуцентами амилолитических ферментов.

Грибы рода Alternaria относятся к классу несовершенных грибов – дейтеромицетов. Это высшие грибы. Они имеют септированный мицелий и короткие несептированные конидиеносцы, на которых находятся многоклеточные конидии грушевидной или лимоновидной формы (рис. 5). Гриб является возбудителем черной гнили – болезни корнеплодов и плодов, а также возбудителем порчи пищевых продуктов.

Морфология дрожжей и их характеристика

Дрожжи – это высшие одноклеточные грибы. Большинство дрожжей относится к двум классам грибов – аскомицетам и дейтеромицетам.

Дрожжи по отношению к кислороду делятся на факультативные анаэробы (в аэробных условиях осуществляют дыхание и активно накапливают биомассу, а в анаэробных условиях вызывают спиртовое брожение) и аэробы.

Морфологически дрожжи разнообразны. Они отличаются друг от друга размерами и формой клеток. Размеры клеток дрожжей в зависимости от вида варьируют в следующих пределах; от 2,5 до 10 мкм в поперечнике и от 4 до 20 мкм в длину. Морфологическое разнообразие форм дрожжей изображено на рис. 6.

а

б

в

г

д

е

ж

з

Рис. 6 Формы дрожжевых клеток: а - овальная яйцевидная;

б - цилиндрическая; в – апикулятная; лимоновидная; г – стреловидная;

д – треугольная; е – серповидная; ж – колбовидная; з, и - мицелевидная

Форма и размеры дрожжевых клеток зависят от вида, возраста, питательной среды, способа культивирования.

В зависимости от вида дрожжи вегетативно могут размножаться почкованием (так размножаются дрожжи овальной формы), бинарным делением (характерно для дрожжей цилиндрической или палочковидной формы) или почкующимся делением. Кроме вегетативного размножения, дрожжи – аскомицеты могут размножаться половым путем с образованием аскоспор.

Из дрожжей, относящихся к классу аскомицетов, большое значение имеют дрожжи-сахаромицеты рода Saccharomyces , которые широко используются в пищевой промышленности. Главным биохимическим признаком этих дрожжей является то, что они сбраживают сахара с образованием этилового спирта и диоксида углерода. Дрожжи, используемые в промышленности, называются культурными дрожжами. Так, в хлебопекарном производстве и в производстве спирта используются верховые дрожжи рода Saccharomyces cerevisiae . Дрожжи вида Saccharomyces minor нашли применение в производстве ржаного хлеба и кваса. В пивоварении используются низовые дрожжи Saccharomyces carlsbergensis . Дрожжи-сахаромицеты имеют овальную форму, вегетативно размножаются почкованием, в неблагоприятных условиях размножаются половым путем аскоспорами.

Некоторые спорогенные дрожжи являются дикими дрожжами . Эти дрожжи так же, как и культурные, способны осуществлять спиртовое брожение, но помимо спирта образуют много побочных продуктов (таких как альдегиды, высшие спирты, эфиры и др.) и поэтому ухудшают органолептические показатели продукта. Эти дрожжи являются вредителями производства различных напитков (пива, вина, безалкогольных напитков), а также возбудителями порчи многих пищевых продуктов.

Дрожжи - дейтеромицеты могут размножаться только вегетативным способом. Некоторые из этих дрожжей (например, дрожжи рода Candida ) используются в промышленности для получения кормового белка, органических кислот, витаминов и других продуктов микробного синтеза. Дрожжи вида Torulopsis kefir входят в состав симбиотической закваски – кефирного грибка. Другие представители несовершенных (аспорогенных) дрожжей являются дикими дрожжами и вызывают порчу многих пищевых продуктов. К дрожжам- вредителям производства относятся дрожжи родов Pichia , Hansenula , Candida , Rhodotorula, Torula , Torulopsis , Mycoderma , Trichosporon и др. Среди аспорогенных дрожжей встречаются ложные дрожжи , которые образуют псевдомицелий и растут на жидких субстратах в виде пленок.

1. ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ

На предметное стекло трубочкой или пипеткой наносят большую каплю воды;

Отбирают небольшое количество мицелия из пробирки или чашки Петри, соблюдая правила асептики

Мицелий аккуратно помещают в каплю, нанесенную на предметное стекло и с помощью двух игл расправляют его в воде;

Препарат накрывают покровным стеклом и слегка придавливают. Излишки воды удаляют с помощью фильтровальной бумаги.

Микроскопируют препарат «раздавленная капля» сначала с объективом х8, а затем х40 в затемненном поле зрения (конденсор опущен, шторка ирис-диафрагмы прикрыта).

При отборе и микроскопии препаратов грибов учитывают следующие рекомендации:

а) гриб рода Mucor . Отбирают черновато-серый пушистый воздушный мицелий. При микроскопии обращают внимание на гифы с заполненными спорами спорангиями и колонки, которые образуются при освобождении спорангия;

б) гриб рода Aspergillus . Отбирают немного пушистого мицелия с окрашенными конидиями, слегка углубляясь иглой в питательную среду. Обращают внимание на несептированные конидиеносцы;

в) гриб рода Penicillium . При отборе стараются взять молодой мицелий (на границе окрашенного и белого мицелия), углубляясь иглой в среду. Обращают внимание на септированные гифы с кисточками.

г) гриб рода Alternaria . Берут грибницу в черных участках, углубляясь в нее иглами. Обращают внимание на септированный мицелий, слабо развитые конидиеносцы и крупные конидии, имеющие вид округлых или заостренных многоклеточных образований, напоминающих «гранаты-лимонки».

При исследовании дрожжей на предметное стекло наносят суспензию дрожжей, накрывают покровным стеклом, излишки воды удаляют фильтровальной бумагой. Микроскопируют препарат и объективом х8 и х40.

Оформление и анализ результатов исследований

Кратко конспектируют теоретический материал. Зарисовывают микроскопические картины исследованных культур грибов и дрожжей с учетом морфологических особенностей каждого микроорганизма. Под каждым рисунком подписывают латинское название и увеличение препарата. Описывают культуральные свойства изучаемых грибов.

Ответить на контрольные вопросы

Как готовятся препараты микроскопических грибов и дрожжей?

Охарактеризуйте морфологические и культуральные свойства микроскопических грибов.

Какие грибы используются в промышленности для получения органических кислот, ферментов, антиб0иотиков и других ценных продуктов?

Охарактеризуйте морфологические свойства дрожжей.

Что такое культурные дрожжи? В каких отраслях пищевой промышленности они используются?

Условия выполнения задания

Кабинет биологии

2. Максимальное время выполнения задания: 90 мин

Практическая работа №3: Схемы строения клеток бактерий, дрожжей, грибов.

Цель работы: Изучить строение клетки бактерий, дрожжей, грибов

Материальное обеспечение: инструктивные карты для выполнения практической работы, учебник, карандаши

Задание 1

Изучит материал учебника. По результатам изучения:

Зарисуйте в тетрадь строение клетки бактерий, дрожжей и грибов и укажите отличительные признаки

Письменно ответить на вопросы:

1. Какую форму имеют клетки бактерий?

2. Каковы размеры бактерий?

3.Каким образом происходит размножение бактерий, скорость размножения?

4.Каким образом, и в каких условиях происходит образование спор у бактерий?

5.Способны ли бактерии к самостоятельному движению?

Сделайте вывод по результатам работы.

Условия выполнения задания

1. Место (время) выполнения задания

Кабинет биологии

2. Максимальное время выполнения задания: 90 мин

Практическая работа по теме №4 Работа с нормативно-технической документацией: СанПиН 2.3.6. 1079-01

Цель работы: Изучить санитарные требования к устройству и содержанию предприятий общественного питания

Материальное обеспечение: инструктивные карты для выполнения практической работы, СанПиН 2.3.6. 1079-01

Задание 1

Изучит материал учебника. СанПиН 2.3.6. 1079-01. По результатам изучения:

1. Допишите фразы: Участок, где построено предприятие общественного питания, должен быть

К производственным помещениям относятся:

Складские помещения проектируются в ____________________ части здания.

Питьевая вода по качеству должна соответствовать

Для очистки воздуха используется вентиляция

Типа.

Все производственные помещения должны освещаться

Светом.

Ежемесячная уборка помещений называется

2. Дайте определение следующим понятиям:

Дезинфекция это –

Дератизация это –

Дезинсекция это –

3. Используя учебный материал, заполните таблицу:

Овощной цех

Мясной цех

Рыбный цех

Горячий цех

Холодный цех

Кондитерский цех

Раздаточная

Условия выполнения задания

1. Место (время) выполнения задания

Кабинет биологии

2. Максимальное время выполнения задания: 90 мин

Практическая работа № 5 Работа с нормативно-технической документацией: СанПиН 2.3.6. 1079-01

Цель работы : Изучить санитарные требования к оборудованию, инвентарю, посуде, таре. Транспортировке и хранению пищевых продуктов.

Материальное обеспечение : инструктивные карты для выполнения практической работы, СанПиН 2.3.6. 1079-01

Задание 1

Изучит материал учебника, СанПиН 2.3.6. 1079-01. По результатам изучения:

1. Письменно ответьте на вопросы:

Что относится к кухонной посуде?

Для чего маркируют посуду?

Что относится к столовой посуде?

Какие материалы допускаются для производства оборудования и инвентаря

для предприятий общественного питания?

В чем состоит принципиальная разница при мытье столовой посуды и столовых приборов?

2. Перечислите правила и требования:

2.1. Санитарные правила перевозки полуфабрикатов:

2.2. Санитарные правила хранения пищевых продуктов:

3. Допишите фразы:

До начала раздачи качество готовых блюд должно

При подаче первые блюда и горячие напитки должны иметь температуру

_______ °С, вторые блюда и гарниры температуру ______ °С, порционные блюда

температуру ______ °С, холодные блюда и напитки ______ °С.

В лечебно-профилактических и детских учреждениях в зимне-весенний период из-за недостатка в овощных блюдах ___________________ требуется обогащать этим некоторые блюда.

За качество готовой продукции и соблюдение правил её отпуска на предприятиях общественного питания несут ответственность ________________

Условия выполнения задания

1. Место (время) выполнения задания

Кабинет биологии

2. Максимальное время выполнения задания: 90 мин

Практическая работа № 6 Схемы приготовления дезинфицирующих растворов и их хранение

Цель: изучить наименование дезинфицирующих средств, способы приготовления дезинфицирующих растворов в зависимости от назначения. Приготовить раствор заданной концентрации.

Материальное обеспечение : инструктивные карты для выполнения практической работы, СанПиН 2.3.6. 1079-01, учебник

Задание 1

Изучит материал учебной литературы, СанПиН 2.3.6. 1079-01. По результатам изучения:

1. Ответить на вопросы:

Какие растворы относятся к дезинфицирующим?

С какой целью применяют дезинфицирующие растворы?

Какие препараты используют как дезинфекторы?

Как распознать что посуду обрабатывали дезинфекторами?

2. Изучить схемы приготовления и назначение дезинфицирующих средств. Заполнить таблицу.

3. Приготовить 1литр 0,2 % раствора хлорамина Б.

4. Сделать вывод по результатам работы.

Условия выполнения задания

1. Место (время) выполнения задания

Кабинет биологии

2. Максимальное время выполнения задания: 90 мин

Критерии оценок за выполнение практической работы:
Оценка «5» ставится, если :
1. Правильной самостоятельно определяет цель данных работ; выполняет работу в полном объёме с соблюдением необходимой последовательности проведения.
2. Самостоятельно, рационально выбирает и готовит для выполнения работ необходимое оборудование; проводит данные работы в условиях, обеспечивающих получение наиболее точных результатов.
3. Грамотно, логично описывает ход работ, правильно формулирует выводы; точно и аккуратно выполняет все записи, таблицы, рисунки, чертежи, графики, вычисления.
4. Проявляет организационно-трудовые умения: поддерживает чистоту рабочего места, порядок на столе, экономно расходует материалы; соблюдает правила техники безопасности при выполнении работ.
Оценка «4» ставится, если :
1. Выполняет лабораторную работу полностью в соответствии с требованиями при оценивании результатов на "5", но допускает в вычислениях, измерениях два - три недочёта или одну негрубую ошибку и один недочёт.
2. При оформлении работ допускает неточности в описании хода действий; делает неполные выводы при обобщении.
Оценка «3» ставится, если :
1.1 Правильно выполняет работу не менее, чем на 50%, однако объём выполненной части таков, что позволяет получить верные результаты и сделать выводы по основным, принципиальным важным задачам работы.
2. Подбирает оборудование, материал, начинает работу с помощью преподавателя; или в ходе проведения измерений, вычислений, наблюдений допускает ошибки, неточно формулирует выводы, обобщения.
3. Проводит работу в нерациональных условиях, что приводит к получению результатов с большими погрешностями; или в отчёте допускает в общей сложности не более двух ошибок (в записях чисел, результатов измерений, вычислений, составлении графиков, таблиц, схем и т.д.), не имеющих для данной работы принципиального значения, но повлиявших на результат выполнения.
4. Допускает грубую ошибку в ходе выполнения работы: в объяснении, в оформлении, в соблюдении правил техники безопасности, которую ученик исправляет по требованию учителя.
Оценка "2" ставится, если :
1. Не определяет самостоятельно цель работы, не может без помощи преподавателя подготовить соответствующее оборудование; выполняет работу не полностью, и объём выполненной части не позволяет сделать правильные выводы.
2. Допускает две и более грубые ошибки в ходе работ, которые не может исправить по требованию педагога; или производит измерения, вычисления, наблюдения неверно.

ПРИЛОЖЕНИЕ.

Приложение 1

ПАМЯТКА СТУДЕНТУ

При выполнении работы студент обязан:

Предварительно подробно ознакомиться с теоретическим материалом и хорошо понять микробиологические закономерности и процессы, которые предстоит изучить на практике.

Выполняя эксперимент, соблюдать все меры предосторожности, последовательность операций, проводя нужные наблюдения.

Записать результаты опыта в тетради по схеме, предложенной в работе:

После окончания работы привести в порядок рабочее место и сдать его лаборанту или преподавателю.

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ

КАРАЧАЕВО-ЧЕРКЕССКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ

Кафедра технологии производства продуктов животноводства

МИКРОБИОЛОГИЯ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

к лабораторным и практическим занятиям студентам

аграрного института

Черкесск – 2010

Составлены на основе примерной и рабочей программ по курсу «Микробиология» в соответствии с Государственным образовательным стандартом высшего профессионального образования по специальности 110305 «Технология производства и переработки сельскохозяйственной продукции» и 110201 «Агрономия» (2000 г.).

Обсуждены на заседании кафедры ТППЖ (протокол от 2.07.2009 г.)

Утверждены методической комиссией Аграрного института (протокол №6 от 01.01.2001 г.). Опубликованы по решению учебно-методического совета Карачаево-Черкесской государственной технологической академии (протокол от 01.01.2001г.)

Составители: кандидат биологических наук, доцент , кандидат сельскохозяйственных наук, доцент , ассистент

Рецензенты: – кандидат биологических наук

доцент кафедры «Агрономия»

доцент кафедры «ТППЖ»

Редактор: к. с.-х. наук, доцент
Содержание

Введение……………………………………………………………………….. 6

1. Микроскопия……………………………………………………………….. 7

1.1.Светопольная микроскопия……………………………………………. .7

1.1.1. Устройство микроскопа……………………………………………… 7

2. Работа с микроорганизмами ………………………………………………. 8

2.1.Методы приготовления препаратов…………………………………..... 8

2.1.1.Техника взятия культуры для препаратов…………………………… 8

2.1.2. Исследование живых клеток микроорганизмов методом раз-

давленной капли……………………………………………………….. 8

2.1.3. Фиксированные препараты микроорганизмов……………………… 9

Осветительная система находится под предметным столиком. Зеркало отражает падающий на него свет в конденсор. Одна сторона зеркала плоская, другая – вогнутая. При работе с конденсором необходимо пользоваться плоским зеркалом. Вогнутое зеркало применяют при работе без конденсора с объективами малых увеличений. Конденсор состоит из 2-3 короткофокусных линз, собирает лучи, идущие от зеркала и направляет их на объект. Конденсор необходим при работе с иммерсионными системами. В конденсоре есть ирисовая (лепестковая) диафрагма, состоящая из стальных серповидных пластинок.

Окрашенные препараты рассматривают при почти полностью открытой диафрагме, неокрашенные – при уменьшенном отверстии диафрагмы.

Объектив – многолинзовая система, от качества которой зависит изображение объекта. Наружная линза называется фронтальной, она обеспечивает увеличение. Остальные линзы выполняют функции коррекции оптических недостатков.

Объективы бывают сухие и погруженные (иммерсионные). При работе с сухими объективами между фронтальной линзой объектива и объектом исследования находится воздух. При работе с иммерсионным объективом V=90х между покровным стеклом и линзами объектива находится кедровое масло, показатель преломления которого близок к показателю преломления стекла 1,515 и 1,52 соответственно. Объективы имеют увеличение 8х, 40х и 90х.

Окуляр служит непосредственным продолжением «линз» (хрусталиков) глаз человека.

Окуляр состоит из двух линз – верхней – глазной и нижней – собирательной, заключенных в металлическую оправу. Назначение окуляра – увеличение изображения, которое дает объектив. Увеличение окуляра выгравировано на его оправе. Рабочее увеличение окуляров в пределах от 4х до 15х.

Окуляры бывают разных типов, и выбор зависит от объектива. При длительной работе с микроскопом пользуются бинокулярной насадкой, так как она улучшает видимость объекта, снижает яркость изображения и тем самым сохраняет зрение.

Работа с микроорганизмами

2.1. Методы приготовления препаратов

2.1.1. Техника взятия культуры для препаратов

Обожженной в пламени бакте­риологической иглой из пробирки берут небольшое количество микробной массы. Если культура жидкая, то лучше для этого пользоваться петлей, в других случаях – иглой.

2.1.2. Исследование живых клеток микроорганизмов методом раздавленной капли

Исследуют живые клетки микроорганизмов методом раздавленной капли, предварительно проводят окрашивание объекта прижизнен­ными красителями - витальная окраска (красители: метиленовый синий, нейтральный красный в концентрациях от 0,001 до 0,0001%).

Препараты микроскопируют, слегка затемняя поле зре­ния; конденсор немного опускают, поступление света регули­руют вогнутым зеркалом. Вначале пользуются малым увеличением – объектив 8х, после того как обнаруживают край капли, устанавливают объектив 40х или иммерсионный (90х).

В случае использования метода раздавленной капли на чистое предметное стекло наносят каплю водопроводной воды. В нее вносят культуру и смешивают с водой. Избыток воды удаляют фильтровальной бумагой. При использовании иммерсионного объектива на предметное стекло наносят каплю кедрового масла и микроскопируют.

2.1.3. Фиксированные препараты микроорганизмов

Фиксированные препараты предполагают та­кую обработку живых клеток, которая дает возможность бы­стро прервать течение жизненных процессов в объекте, сохра­нив его тонкую структуру. В результате фиксации клетки прочно прикрепляются к стеклу и лучше прокрашиваются. Фиксация необходима в случае работы с патогенными микро­организмами (в целях безопасности).

Приготовление мазка. На чистое обезжиренное предмет­ное стекло наносят каплю водопроводной воды. Для обезжи­ривания стекол используют смесь этилового спирта и серного эфира в соотношении 1:1. Прокаленной бактериологической иглой из пробир­ки с культурой берут небольшое количество микробной массы и вносят в каплю воды. Каплю тщательно размазывают пет­лей по стеклу на площади около 4 см2.

Если суспензия густая, ее сначала разводят во­дой. Для этого прокаленной петлей берут немного суспензии и переносят в каплю воды на другое предметное стекло. Сус­пензию нормальной густоты размазывают тонким слоем по стеклу, затем мазок сушат на воздухе при комнатной темпера­туре или при слабом нагревании, держа препарат высоко над пламенем горелки. Сильное нагревание препарата при сушке не рекомендуется для избежания коагуляции белков, искажаю­щей структуру и форму клеток. Высушенный препарат фикси­руют.

Фиксация мазка. Ее проводят над пламенем горелки или при помощи химических со­ единений. В пер­вом случае препарат три-четыре раза медленно проводят нижней стороной над пламенем горелки, во втором случае используют хромовые соединения: формалин, осмиевую кис­лоту, ацетон . Один из распространенных приемов фиксации – обра­ботка препарата 96%-ным спиртом или смесью равных объ­емов этилового спирта и эфира (жидкость Никифорова). Для этого препараты погружают на 10-30 мин в фиксирующую жидкость.

Окрашивание препарата. На мазок наносят несколько капель красителя. В зависимости от вида красителя и цели исследования продолжительность окрашивания варьи­рует от 1 до 5 мин, в отдельных случаях занимая до 30 мин. По окончании окрашивания препарат промывают во­дой, фильтровальной бумагой удаляют воду, подсушивают на воздухе и микроскопируют.

Существуют простые и дифференцированные методы окраски.

При простой окраске используют какой-либо один кра­ситель (метиленовый синий, фуксин, генциан фи­олетовый), прокрашивается вся клетка.

При дифференцированной окраске отдельные структуры клетки окрашиваются разными красителями (окраска по Граму, окраска спор).

Исследование морфологии микроорганизмов

3.1. Форма клеток

3.1.1. Бактерии

По форме все бактерии делят на шаровидные (кокки), палочковидные и извитые.

Шаровидные бактерии – кокки.

1. Микрококки – одиночные шаровидные клетки (Micrococcus agilis ).

2. Диплококки – шаровид­ные кокки, соединенные по двое. (Azotobacter chroococcum ).

3. Тетракокки – шаровидные кокки, соединенные по четыре.

4.Стрептококки – шаровидные бактерии, соединенные в цепочки (в основном относятся патогенные, а также молочнокислые бактерии Lactococcus lactis ).

5. Сарцины – шаровидные бактерии, группирующиеся по 8 клеток, возникают в результате деления клетки в трех взаимно перпендикулярных плоскостях. Некоторые виды сарцин формируют большие кубообразные пакеты, в которых с каждой стороны находится по 4 сарцины. Типичный представитель Sarcina flava (сарцина желтая) - наиболее распространенный представитель микрофлоры воздуха.

Все шаровидные формы бактерий, за исключением Streptoctococcus lactis , просматривают на фиксированных и окрашен­ных фуксином препаратах.

Палочковидные бактерии. К ним относят формы не образую­щие споры (роды Pseudomonas , Achromobacter , Lactobacillus и др.) и обра­зующие споры (роды Bacillus , Clostridium и др.).

Неспорообразующая палочка Pseudomonas stutzeri – цитоплазма ее прокрашивается равномерно.

Спорообразующие палочки Bacillus mycoides и Bacillus mesentericus. Под микроскопом выглядят неравномерно окрашен­ными. Споры не окрашиваются, как более плотные структуры. Клетки Bacillus mycoides располагаются цепочками, это стрептобациллы.

Палочковидные бактерии просматривают на фиксиро­ванных и окрашенных препаратах.

Извитые формы

1. Вибрионы – слегка изогнутые клетки.

2. Спи­риллы могут иметь один завиток в виде русской буквы С, два завитка в виде латинской буквы S или несколько - в виде спирали.

3. Спирохеты - длинные и тонкие клетки с большим ко­личеством завитков; длина клеток превы­шает их толщину в 5-200 раз.

Вибрионы и спириллы удобно просматривать на фикси­рованном и окрашенном препарате, приготовлен­ном из навозной жижи, предварительно инкубированной в те­чение нескольких суток в термостате. Из множества микроорганизмов на таком препарате часто встречаются извитые формы.

Со спирохетами можно познакомиться на фиксированном окрашенном препарате зубного налета, особенно удачны препараты соскоба из кариесного зуба. Зуб­ные спирохеты очень тонкие, волосовидные, ко­роткие (всего 2-3 завитка).

3.1.2. Актиномицеты

Актиномицеты – лучистые грибы. Мицелий актиномицетов на питательных средах дифференцирован: одна часть его погружена в субстрат (субстратный мицелий), другая находится над субстратом (воздушный мицелий).

Многие представители актиномицетов продуцируют пиг­менты, поэтому их воздушный мицелий и особенно колонии окрашены в голубой, синий, фиолетовый, розовый, бурый, ко­ричневый или черный цвета. Актиномицеты окрашивают питательную среду в соответствующие цвета.

На предметное стекло наносят кусочек ко­лонии актиномицета вместе со средой. Вторым пред­метным стеклом плотно прижимают этот кусочек к стеклу, раздавливают и размазывают по стеклу. Препарат сушат, фиксируют, красят, просматривают под микроскопом, где частично просматриваются мицелиальные одноклеточные нити.

3.1.3. Дрожжи

Дрожжи – одноклеточные микроскопические грибы разнообразные по форме: эллипсовидная, грушевидная, округлая, ци­линдрическая. Размножаются вегетативным и половым путем.

Для лабораторных занятий используют пекарские дрожжи. Небольшой кусочек дрожжевой массы за несколько часов до занятий помещают в теплую подсахарен­ную воду и ставят в теплое место. Образуется беловатая мутная жидкость. Каплю этой жидкости наносят на предметное стек­ло, накрывают покровным стеклом, сверху наносят каплю кед­рового масла и просматривают препарат с иммерсионной сис­темой. Видны почкующиеся и делящиеся клетки.

3.2. Химические методы исследования

3.2.1. Окраска клеток микроорганизмов по Граму

Этот метод дифференциации мик­робных клеток основан на различии в химическом составе клеточных оболочек. В клетках одних видов микроорганизмов образуется нерастворимое в спирте соединение йода с основным красителем, а у других видов это соединение появляется временно и после обработки спир­том растворяется. Микроорганизмов первой группы называют грамположительными второй - грамотрицательными.

Техника окраски по Граму. На обезжиренное предметное стекло наносят три тонких мазка разных культур микроорганизмов (два из них - контрольные, с заведомо из­вестным отношением к окраске по Граму). Мазки высушива­ют на воздухе, фиксируют над пламенем горелки и окрашива­ют в течение 1 мин феноловым раствором генциана фиолето­вого (или кристаллического фиолетового), держа стекло в слегка наклонном положении. Затем краситель сливают и, не промывая препарат водой, наносят на него на 1 мин раствор Люголя (до полного почернения мазка). Стекло держат в наклонном положении. Препа­рат, не промывая водой, обрабатывают, непрерывно покачи­вая, 96%-ным спиртом в течение 15-20 с. Важно придерживаться времени обесцвечивания, так как при превы­шении указанного срока обесцвечиваются и грамположитель­ные клетки.

Промыв водой, препарат окрашивают фуксином Пфейфера в течение 1 мин. Грамположитель­ные микроорганизмы приобретают темно-фиолетовый цвет, а грамотрицательные окрашиваются в цвет дополнитель­ной окраски (фуксина).

Результаты окраски по Граму зависят от возраста культу­ры: в старых культурах мертвые клетки всегда окрашиваются грамотрицательно. Поэтому лучше использовать молодые односуточные культуры.

Хорошими объектами для окраски клеток микроорганиз­мов по Граму служат дрожжи, Bacillus mesentericus или Bacillus subtilis (грамположительные) и кишечная палочка Escherichia coli (грамотрицательная).

Красители и реактивы для окраски по Граму.

1. Феноловый рас­твор генциана фиолетового: генциан фиолетовый - 1 г, спирт 96%-ный - 10 мл, фенол кристаллический - 2 г, вода дистил­лированная - 100 мл.

В некоторых случаях применяют спиртовой раствор генциана фиолетового: генциан фиолетовый (или кристаллический фи­олетовый) - 1 г, спирт 96%-ный (ректификат) - 100 мл, гли­церин - 5 мл. Смесь ставят в термостат на 24 ч, затем фильтруют.

2. Раствор Люголя (иодит калия - 2 г, иод кристаллический - 1 г, вода дистиллированная - 300 мл). Вначале готовят кон­центрированный раствор иодита калия в 5 мл воды, в нем рас­творяют иод, потом добавляют воду до 300 мл.

3. Спирт 96%-ный.

4. Фуксин Пфейфера (водный раствор карболового фуксина Циля): 1 мл карболового фуксина Циля и 9 мл дистил­лированной воды. Готовят его так: 1 г фуксина, 5 г фенола кристаллического, 96 % спирт – 10 мл, несколько капель глицерина, 100 мл дистиллированной воды, фуксин растворяют в этаноле, добавляют растворенный в воде фенол. Раствор перемешивают и оставляют на несколько дней. Перед использованием его фильтруют.

3.2.2. Окраска спор у бактерий

Споры бактерий по сравнению с ве­гетативными клетками обладают высокой устойчивостью к неблагоприятным условиям внешней среды. Они представ­ляют собой округлые, овальные или эллипсовидные образова­ния. Если диаметр споры не превышает диаметра клетки, в которой спора образуется, клетку называют бациллярной, ес­ли превышает, то в зависимости от расположения споры в центре или на конце клетки эту клетку называют соответ­ственно клостридиальной или плектридиальной . В бацилляр­ной клетке спора может размещаться в центре клетки - центральное положение, на конце - терминальное и ближе к одному из концов - субтерминальное положение.

При наблюдении за живыми спорообразующими бакте­риями их споры можно различить по более сильному прелом­лению световых лучей. Споры кислотоустойчивы, поэтому с трудом окрашиваются красителями. Объясняется это боль­шой плотностью оболочки, низкой концентрацией в ней сво­бодной воды и высоким содержанием липидов в спорах. В препаратах, окрашенных простыми способами или по Граму, спо­ры остаются бесцветными (негативная окраска).

Все способы окраски спор основаны на едином принципе : сначала споры протравливают различными веществами: хромовой, соляной, серной, уксусной кислотами, аммиаком , едким натром или перекисью водорода , затем окра­шивают клетку со спорой при нагревании и, наконец, обесцве­чивают цитоплазму и дополнительно окрашивают ее контраст­ным красителем.

Метод Циля-Нильсена в модификации Мюллера. До фиксации мазка бактерий на пламени препарат гото­вят обычным способом. Далее на фиксированный в пламени и остывший препарат наносят 5%-ный раствор хро­мовой кислоты. Через 5-10 мин ее смывают водой. Препарат накрывают полоской фильтровальной бумаги и обильно сма­чивают бумагу карболовым фуксином Циля. Подогревают пре­парат над пламенем до появления паров (не до кипения), затем отводят его в сторону и добавляют новую порцию красителя. Эту процедуру проводят в течение 7 мин. Важно, чтобы краси­тель испарялся, но бумага не подсыхала. После охлаждения ее снимают, препарат промывают водой и тщательно промокают фильтровальной бумагой. В результате такой обработки клетки со спорами равномерно прокрашиваются.

Далее обесцвечивают цитоплазму клеток (но не споры), обрабатывая 1%-ным раствором соляной или серной кислот в течение 15-30 с. При приготовлении препарата спор Bacillus mycoides или Bacillus mesentericus рекомендуется обесцвечивать цитоплазму 16-18 с (размеренно считая вслух от 21 до 37-40). При превышении этого времени могут обесцветиться и споры. Затем препарат промывают водой и окрашивают метиленовым синим 2 мин.

Окраска полу­чается контрастной и ярко-красные споры четко выделяются на голубом фоне цитоплазмы.

Метод Пешкова. На фиксированный в пламени препарат наливают метиленовый синий Леффлера, доводят его до ки­пения и кипятят 15-20 с, держа стекло над пламенем. Мазок промывают водой и докрашивают в течение 30 с 0,5%-ным водным раствором нейтрального красного. Еще раз промыва­ют, подсушивают и далее исследуют препарат с масляной им­мерсией объектива. Споры окрашиваются в голубой или си­ний цвета, цитоплазма - в розовый.

Для исследования спор удобными объектами могут слу­жить Bacillus mesentericus или Bacillus mycoides в возрасте 4 сут.

Реактивы для окрашивания спор бактерий. 1. Карболовый фуксин Циля (см. 3.2.1).

2. Метиленовый синий Леффлера (см. 3.2. .1).

3. Насыщенный водный раствор метиленового синего. 2 г красите­ля и 100 мл дистиллированной воды.

4. Хромовая кислота, 5%-ный раствор.

5. Соляная (или серная) кислота, 1%-ный раствор.

4. Культивирование микроорганизмов

4.1. Питательные среды

4.1.1. Приготовление питательных сред

Мясо-пептонный бульон (МПБ). Для приготовления мясо-пептонных сред используют мясной бульон, который полу­чают следующим образом: 500 г мелко изрубленного свежего мяса заливают в эмалирован­ной кастрюле 1 л водопроводной воды, нагретой до 50°С, и оставляют настаиваться 12 ч при комнатной температуре или 1 ч при 50-55 °С. Мясо отжимают, экстракт процежива­ют через марлю со слоем ваты, кипятят 30 мин для свертыва­ния коллоидных белков и фильтруют дважды (первый раз че­рез марлю с ватой, второй - через бумажный фильтр). Фильтрат доливают водой до 1 л, разливают в колбы, закры­вают ватными пробками и стерилизуют при 120°С 20 мин (пробки колб закрывают сверху колпачками из бумаги).

Мясной бульон может быть использован в любое время для приготовления сред. Если их готовят сра­зу, то предварительная стерилизация мясного бульона не требуется.

Для приготовления МПБ к 1 л мясного бульона добавля­ют 5-10 г пептона (первый продукт гидролиза белка) для по­вышения калорийности среды и 5 г поваренной соли для созда­ния осмотической активности. Среду нагревают до растворе­ния пептона, постоянно помешивая.

Устанавливают нейтральную или слабощелочную реакцию среды, приливая 20%-ный раствор Na2C03 до посине­ния влажной красной лакмусовой бумажки. Для проверки рН среды удобно использовать индикатор бромтимолблау: 1-2 капли его смешивают в фарфоровой чашке с каплей бульона. В нейтральной среде бромтимолблау - бутылочно-зеленый, в кислой - желтый, в щелочной - синий.

После установления рН среду снова кипятят 5-10 мин, и белки, свернувшиеся при изменении реакции среды, от­фильтровывают через бумажный фильтр без осветления бульо­на или осветлив его белком. Для этого свежий яичный белок взбивают с двойным по объему количеством воды и смешива­ют с охлажденным до 50°С бульоном. Смесь кипятят, поме­шивая, на слабом огне 10 мин, затем фильтруют. Прозрачный мясо-пептонный бульон разливают в пробирки, закрывают ватными пробками и стерилизуют при 120 °С 20 мин.

Мясо-пептонный агар (МПА). К 1 л МПБ добавляют 15-20 г агара. Среду нагревают до растворения агара (температура его плавления - 100°С, затвердевания - 40°С), устанавлива­ют слабощелочную реакцию среды 20%-ным раствором Na2C03 и через воронку разливают в пробирки (приблизитель­но по 10 мл агара столбиком для последующего разлива по чашкам Петри и по 5 мл для получения скошенного агара - косяков).

При разливе агара края пробирок должны оставаться сухими, иначе пробки прилипнут к стеклу. Пробирки со средой стерилизуют в автоклаве при 120°С 20 мин.

4.2. Методы стерилизации

Стерилизация – это полное уничтожение клеток микроорганизмов в питательных средах, посуде и пр.

Известно несколько методов стерилизации. Чаще применяют стерилизацию нагреванием.

4.2.1. Фламбирование, или прокаливание

Прокаливать можно непосредственно перед употреблением платиновые петли, иглы, шпатели, мелкие металлические предметы (ножницы, ланцеты, пинцеты), а также стеклянные палочки, предметные, покровные стекла и т. д.

4.2.2. Стерилизация сухим жаром

Ее применяют для обработки посуды и сухих материалов, на­пример крахмала, мела. При этом стерилизуемый объект вы­держивают при 170 °С в течение 2 ч (с момента, установления необходимой температуры) в электросушильных шкафах. Поднимать темпе­ратуру выше 170°С не рекомендуется: ватные пробки и бумага начинают разрушаться.

Перед стерилизацией стеклянную посуду закрывают ват­ными пробками и обертывают бумагой. Чашки, пробирки, пи­петки, вату, марлю заворачивают в бумагу или помещают в особые футляры и пеналы, в которых стерильная посуда мо­жет храниться после стерилизации.

По окончании стерилизации шкаф открывают только после того, как температура снизится до комнатной, иначе стекло может лопнуть.

4.2.3. Стерилизация текучим паром

Текучим паром (100 °С) обрабатывают предметы, портящиеся от сухого жара, и некоторые питательные среды, не выдержи­вающие более высокой температуры (среды с углеводами, МПЖ, молоко). Проводят стерилизацию в кипятильнике Коха по 30 мин в течение 3 суток ежедневно. Такая стери­лизация называется дробной.

При однократном прогреве при температуре 100 °С в тече­ние 30 мин погибают вегетативные клетки, споры же многих микроорганизмов остаются жизнеспособными. После такого про­грева среду помещают на 24 ч в термостат при 28-30 °С. Споры, сохранившиеся при первом нагревании, успевают, за это время прорасти в вегетативные формы, которые погибают при после­дующем нагревании. Затем эту операцию повторяют еще 2 раза.

4.2.4. Стерилизация насыщенным паром под давлением

Это наиболее быстрый и надежный способ стерилизации, при котором гибнут самые устойчивые споры. С его помощью сте­рилизуют большинство питательных сред, посуду.

Обработку насыщенным паром проводят в герметически закрывающемся толстостенном котле - автоклаве. На крышке или сбоку автоклава находятся кран для выхода пара, манометр и предохранительный клапан. Манометр пока­зывает, на сколько давление пара внутри котла выше нормаль­ного. Для предотвращения взрыва при превышении предель­ного давления срабатывает предохранительный клапан, давая вы­ход пару.

Показателю манометра в физических атмосферах соответ­ствует определенная температура.

Надежной стерилизации достигают нагреванием при 120 °С и давлении 1 атм в течение 20 мин.

Стерилизацию ведут следующим образом. Наливают воду в автоклав, помещают в него стерилизуемые предметы, завин­чивают крышку автоклава и начинают подогрев. Кран оставля­ют открытым до тех пор, пока весь воздух, находящийся в ав­токлаве, не будет вытеснен парами воды. Когда пар начнет вы­ходить из крана непрерывной струей, кран закрывают, доводят давление пара в автоклаве до 1 атм и поддерживают на этом уровне 20-30 мин. Затем нагрев прекращают, ждут, пока стрелка манометра опустится до 0, осторожно (понемногу) от­крывают кран и спускают пар. Только потом отвинчивают крышку автоклава. Если кран открыть раньше, чем упадет дав­ление, то жидкость в стерилизуемых сосудах закипит и вы­толкнет из них пробки.

Автоклав используют и для дробной стерилизации теку­чим паром. В этом случае крышку не завинчивают, чтобы обеспечить свободный выход пару.

4.2.5. Пастеризация

Пастеризация представляет собой неполную, или частичную, стерилизацию, что означает нагревание при 65-80°С в течение соответственно 30-10 мин с последующим быстрым охлажде­нием до 10-11°С. Пастеризуют молоко, пиво, вино и другие продукты.

Материалы и оборудование

МПБ, агар, лакмус красный, бромтимолблау, фарфоровые пластинки с лунками или чашки, стеклянные палочки, 20%-ный раствор Na2C03, пробирки в штативах (для разливки агара), воронки, вата, чашки Петри, пипетки Мора на 1 мл, бумага для обертывания чашек и пипеток, колбы емкостью 250 мл, суровые нитки.

5. Учет численности и выделение чистой культуры микроорганизмов

5.1. Методы учета численности микроорганизмов

5.1.1. Учет численности микроорганизмов (КОЕ) в почве методом питательных пластин в сочетании с методом последовательных разведений

Почва - наиболее благоприятная среда для развития микроор­ганизмов. В связи с большой гетерогенностью ее состава для учета численности в ней микроорганизмов с исследуемого уча­стка берут среднюю почвенную пробу.

Сначала готовят суспензии (методом разведения), содер­жащие разные концентрации почвы в 1 мл воды. Для этого на стерильное часовое стекло стерильным фарфоровым шпателем или алюминиевой чайной ложкой берут из банки или мешка навеску почвы в 1 г. Часовое стекло, шпатель, ложку фламби-руют в пламени горелки или, смочив в спирте, обжигают. При взвешивании почвы часовое стекло накрывают другим сте­рильным часовым стеклом.

Навеску почвы, соблюдая условия асептики, переносят в колбу на 250 мл с 99 мл стерильной воды. Смесь взбалтыва­ют 5 мин, не смачивая пробку. Стерильной пипеткой берут 1 мл суспензии, содержащей 10-2 г почвы, и переносят в про­бирку с 9 мл стерильной водопроводной воды. Пипетку неод­нократно промывают водой в пробирке, чтобы максимально смыть клетки с ее стенок. Другой стерильной пипеткой берут из колбы еще 1 мл суспензии и помещают во вторую колбу, также содержащую 99 мл стерильной водопроводной воды. Эту пипетку промывают таким же образом, как и в первом случае. Пробирку и вторую колбу взбалтывают 1 мин. Концентрация почвы в пробирке будет 10-3 г, во второй колбе -10-4 г. Точ­но так же новыми стерильными пипетками переносят по 1 мл суспензии из второй колбы во вторую пробирку с 9 мл и в третью колбу с 99 мл стерильной водопроводной воды и готовят новые суспензии, содержащие в 1 мл соответственно 10-5 и 10-6 г почвы.

Транскрипт

1 Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное агентство по образованию Московский государственный университет инженерной экологии Кустова Н.А. ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ ПО МИКРОБИОЛОГИИ Москва 2005

2 Лабораторный практикум по микробиологии предназначен для студентов специальностей 3207 и 3302 по дисциплине «Основы микробиологии и биотехнологии», а также для студентов кафедры «Экологическая и промышленная биотехнология» по дисциплине «Экологическая и промышленная микробиология». Практикум состоит из трех разделов. Первый раздел посвящен вопросам общей микробиологии. В работах этого раздела изучаются морфологическое строение разных групп микроорганизмов, методы микроскопического исследования, техника микробиологических посевов, методы стерилизации и методы количественного учета микроорганизмов. Второй раздел содержит работы по использованию микробов в биотехнологии для получения различных веществ органических кислот, спиртов, антибиотиков, ферментов. В работах третьего раздела изучаются вопросы экологической микробиологии. Часть работ показывает роль микроорганизмов в глобальных биогеохимических циклах, а остальные посвящены проблемам биотехнологической охраны окружающей среды. Каждая тема содержит теоретическое введение и практическую часть, в которой даются описание применяемых методов, порядок выполнения работы, содержание отчета по работе, а также контрольные вопросы. 2

3 ПРЕДИСЛОВИЕ Лабораторный практикум по микробиологии предназначен для студентов 3 курса специальностей 3207 и 3302 по дисциплине «Основы микробиологии и биотехнологии», а также для студентов 4 курса кафедры «Экологическая и промышленная биотехнология» по специализации «Биотехнологическая защита окружающей среды» по дисциплине «Экологическая и промышленная микробиология». В основу Лабораторного практикума положены «Методические указания к лабораторным работам» под ред. П.И.Николаева, которые использовались на кафедре «Процессы и аппараты микробиологических производств» с момента создания кафедры. В преподавание микробиологии при обучении инженеров для микробиологической промышленности огромный вклад внесла с.н.с., к.б.н. Н.В.Поморцева. Методические указания были подготовлены под ее руководством научными сотрудниками кафедры: М.А.Боруздиной, И.Е.Ломовой, Н.А.Кустовой, Т.А.Махоткиной и К.А.Соловьевой. Изменение учебной программы в соответствии с новой специальностью инженер-эколог вызвало необходимость расширить курс микробиологии и дополнить его задачами по биотехнологическим методам защиты окружающей среды. Лабораторный практикум состоит из трех разделов. Первый раздел посвящен общей микробиологии: морфологии микроорганизмов, методам ее изучения, технике микробиологических посевов, методам количественного учета микроорганизмов. Второй раздел охватывает некоторые примеры использования микробов в промышленности. Третий раздел освещает вопросы экологии микроорганизмов, их роль в глобальных циклах элементов, а также в биотехнологических способах охраны окружающей среды. В составлении данного практикума приняли участие аспирант кафедры Н.В.Зябрева и с.н.с. Е.С.Горшина. Автор выражает глубокую благодарность доц. каф. микробиологии МГУ Н.Н. Колотиловой за ценные замечания и советы, а также с.н.с. П.П.Макееву за помощь в оформлении текста и иллюстративного материала. 3

4 4 ОБЩИЕ ПРАВИЛА РАБОТЫ В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ Правила работы и поведения в лаборатории Правила работы и поведения в микробиологической лаборатории имеют много общего с правилами работы в химических лабораториях, но имеют свою специфику. Микробиолог в большинстве случаев работает с чистыми культурами микроорганизмов, т.е. с микроорганизмами какого-либо одного рода, вида и штамма. Поскольку на всех окружающих предметах и в воздухе находятся посторонние микробы, применяются специальные методы работы, чтобы избежать заражения исследуемой культуры микроорганизма или самого человека. Для этого питательные среды, посуду, инструменты стерилизуют, лабораторию и рабочие места содержат в чистоте, соблюдают определенные правила при работе с микробами. В лаборатории не должно быть никаких лишних предметов. Следует регулярно проводить влажную уборку. Различные поверхности лабораторных помещений периодически подвергают дезинфекции. Дезинфекция это обеззараживание, т.е. уничтожение возбудителей инфекционных болезней на объектах внешней среды. Для этого используют 0,5 3%-ный раствор хлорамина или 3 5%-ный раствор фенола (карболовая кислота). Рабочий стол следует дезинфицировать 70%-ным раствором этилового или изопропилового спирта. Дезинфекция воздуха достигается простым проветриванием (не менее мин). Более эффективный способ дезинфекции воздуха облучение помещения ультрафиолетовыми лучами с помощью бактерицидных ламп. Особенно часто ультрафиолетовое облучение применяется для стерилизации бокса. Бокс специальное небольшое помещение для пересевов чистых культур, количественного учета микроорганизмов на чашках Петри и некоторых других работ, требующих особо чистых условий. Перед работой бокс облучают в течение мин. Стол протирают спиртом, стены и пол периодически моют. Вместо бокса лаборатории могут оснащаться ламинарными шкафами (рис. 1), которые также стерилизуются бактерицидными лампами. При

5 работе включают вентилятор для создания ламинарного потока стерильного воздуха, пропущенного через бактерицидные фильтры. Основное оборудование микробиологической лаборатории включает в себя: микроскопы, термостаты для выращивания микроорганизмов, аппаратуру для стерилизации (автоклав и сушильный шкаф), центрифуги, дистиллятор, холодильник для хранения музейных культур микроорганизмов, шкафы для размещения стеклянной посуды и реактивов, необходимые приборы (фотоэлектроколориметры, рн-метры и т.д.). За каждым студентом закрепляют рабочее место, на котором размещают: микроскоп, закрываемый чехлом, бактериологическую петлю, предметные и покровные стекла, стерильные пипетки, спиртовую горелку, полоски фильтровальной бумаги, маркер по стеклу, сосуд с дезинфицирующей жидкостью. На столе не должно быть ничего, не относящегося непосредственно к выполнению работы. На лабораторных занятиях по микробиологии следует соблюдать правила техники безопасности. 5

6 6 Краткие сведения по технике безопасности в лаборатории В микробиологической практике широко применяется посуда из химического стекла. Надо соблюдать осторожность при работе с ней. Осколки разбитой посуды тщательно убирать. При анализах часто применяются крепкие растворы щелочей и кислот. Работать с ними нужно с большой осторожностью, так как эти вещества вредно действуют на кожу рук и одежду. Если кислота случайно пролилась, ее надо засыпать большим количеством соды и затем несколько раз промыть водой. Пролившуюся щелочь надо тщательно вытереть, а предметы, на которые она попала, обработать слабым раствором уксусной кислоты. При попадании кислот или щелочей на кожу человека их необходимо тотчас же смыть большим количеством воды. В микробиологической лаборатории имеют дело с живыми микроорганизмами. Основные работы ведутся стерильно, т.е. работают с одной культурой микроорганизмов, которая не должна заражаться посторонними микробами. Для предупреждения заражения посевов применяют специальные методы стерилизации. Кроме того, важно соблюдать чистоту в лаборатории. Посуда с культурами микроорганизмов не должна оставаться открытой. Биомасса микроорганизмов, если она не нужна для анализов, выбрасывается только после стерилизации в автоклаве. Посевы микроорганизмов производят у пламени газовой или спиртовой горелки, поэтому следует остерегаться ожогов, и прежде всего аккуратно подобрать длинные волосы. Горелка должна гореть только тогда, когда это необходимо. Если при посеве случайно загорится ватная пробка, спиртовка или бумага, огонь гасят полотенцем. При более крупных очагах загорания пользуются огнетушителями. Использованные пипетки, предметные и покровные стекла, шпатели и т.д. помещают в сосуд с дезинфицирующей жидкостью. Студенты должны постоянно помнить, что они имеют дело с микроорганизмами, которые далеко не всегда могут быть безопасными, особенно в работах по выделению микробов из объектов окружающей среды. Поэтому в конце занятия студенты должны привести в порядок рабочее место и вымыть руки с мылом.

7 При неисправности электрической сети нужно выключить электроприборы и их централизованное электропитание. РАЗДЕЛ 1. ОБЩАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ ТЕМА 1. Морфология микроорганизмов и методы ее изучения Микробиология изучает организмы, которые имеют микроскопические размеры, т.е. измеряются микрометрами или долями микрометров. Один микрометр равен 10-6 метра и сокращенно обозначается мкм. Микроорганизмы характеризуются интенсивным обменом веществ и способны осуществлять разнообразные химические превращения. Разные микроорганизмы отличаются и по своему строению и по тем биохимическим процессам, которые они осуществляют. Объединение их в одну группу вызвано не только малыми размерами, но и общностью методов культивирования и исследования. Для изучения строения микроорганизмов, их внешнего вида, формы, размеров, т.е. для изучения морфологии микроорганизмов, пользуются микроскопом. Наименьшие частицы, которые удается увидеть в современные световые микроскопы, имеют величину более 1/3 длины волны света, т.е. не менее 0,2 мкм, что связано с использованием видимой части света, имеющего длину волны от 0,4 мкм до 0,7 мкм. Устройство микроскопа На рис. 2 показан внешний вид распространенного в научноисследовательской и учебной практике микроскопа МБИ-3. Рассматриваемый объект препарат помещается на предметный столик и освещается снизу лучами света, которые выходят из осветителя, падают на зеркало, затем проходят через конденсор и фокусируется на препарате. Основные части микроскопа: окуляры, тубус, револьверная насадка с объективами, предметный столик с зажимами для препаратов, конденсор, макрои микровинты для наведения на резкость и, наконец, штатив, в который все это вмонтировано. 7

8 Перед микроскопированием проверяют правильность установки освещения (по Келеру). Для этого, перемещая патрон осветителя с лампочкой, добиваются четкого изображения нити 8

9 накала лампы на закрытой полностью диафрагме конденсора так, чтобы это изображение полностью заполняло отверстие конденсора. Закрыв диафрагму осветителя, открывают диафрагму конденсора и, перемещая конденсор, добиваются резкого изображения диафрагмы осветителя в поле зрения микроскопа. Чтобы яркий свет не слепил глаза, предварительно уменьшают накал нити лампы. И, наконец, изображение отверстия диафрагмы устанавливают в центре поля зрения, а диафрагму осветителя открывают так, чтобы было освещено все поле зрения. Микроскоп представляет собой оптическую систему с двумя ступенями увеличения: первое увеличение осуществляется объективом, второе окуляром. Объектив дает увеличенное обратное изображение предмета, которое рассматривается в окуляр. В результате глаз наблюдателя видит сильно увеличенное обратное изображение предмета. Поэтому движение объекта налево воспринимается глазом как движение направо. Общее увеличение микроскопа, т.е. увеличение, при котором рассматривают объект под микроскопом, определяется как произведение увеличений объектива и окуляра. Объективы дают увеличение в 10, 40, 60, 90 раз, окуляры в раз. Если применяется бинокулярная насадка, она дает дополнительное увеличение. На рис. 3 показана принципиальная схема оптической системы микроскопа. Объектив О образует в плоскости Z действительное перевернутое изображение А объекта А. Даваемое объективом изображение увеличивается далее при помощи окуляра Е. Так как Z находится в фокусе окуляра Е, наблюдатель видит увеличенное мнимое изображение А в плоскости Х, которая обычно располагается в 25 см от глаза, т.е. на расстоянии, наиболее удобном для ближнего зрения. Следует иметь в виду, что подобное представление о механизме образования изображения является в высшей степени упрощенным, ибо оно игнорирует влияние дифракции и ряда других факторов. В работе с микроскопом студенты изучают препараты микробов с увеличением в раз. Наибольшее увеличение, которое дает оптический микроскоп, 3000 раз. Наименьший размер частиц, которые можно рассматривать в таком микроскопе, 9

10 равен 0,2 мкм, что обусловлено длиной волны видимой части спектра. Морфология микроорганизмов Мир микроорганизмов включает в себя огромное разнообразие форм, которые не составляют единую систематическую группу. Основными объектами микробиологии являются бактерии, но кроме них микробиологи изучают еще дрожжи, грибы, микроскопические водоросли и некоторые простейшие. На рис. 4 представлены основные группы микроорганизмов (за исключением простейших); соотношения их размеров сохранены. Все живые организмы, кроме вирусов, имеют клеточное строение. В соответствии со своей клеточной организацией они делятся на прокариотные и эукариотные. 10

11 Главное отличие эукариот от прокариот состоит в наличии вторичных полостей, отделяющих ядро и другие клеточные структуры от цитоплазмы. Именно появление вторичных полостей позволило совершить скачок в эволюции всего живого мира за счет увеличения внутренней поверхности мембран эукариот. Это дало возможность в соответствии с увеличением скорости диффузии, одновременно осуществлять большее количество протекающих на мембранах биохимических реакций. Прокариотами являются бактерии, в том числе актиномицеты и цианобактерии. Эукариотами все растения, животные, дрожжи, грибы, простейшие. Среди прокариот в настоящее время выделяется группа архебактерий, которая включает в себя метаногенов, экстремальных галофилов, (живущих в очень соленой воде) экстремально термофильных бактерий, окисляющих и восстанавливающих молекулярную серу, а также термоплазм, лишенных клеточной стенки. Новое разделение было сделано на основе сравнения нуклеотидных последовательностей в малых отрезках рибосомных РНК. 11

12 Архебактерии отличаются по составу клеточных стенок, липидов и некоторых других физиолого-биохимических особенностей (например, у них другой механизм фиксации СО 2). Таким образом, в строении клеточной организации в настоящее время выделяют 3 группы: архебактерии, (по новой номенклатуре Archaea, археи), эубактерии (по новой номенклатуре Bacteria, бактерии), и эукариоты (по новой номенклатуре Eukarya). Работа 1. Микроскопическое изучение бактерий Морфология бактерий Теоретическое введение Эта группа микроорганизмов наиболее многочисленна, широко распространена в природе и имеет большое промышленное значение. Для наименования микроорганизмов используют бинарную номенклатуру, как в зоологии и ботанике. В соответствии с этой номенклатурой каждый вид имеет название, состоящее из двух латинских слов. Первое слово означает род, а второе вид. Родовое название всегда пишется с заглавной буквы, а видовое со строчной. Большинство бактерий одноклеточные организмы сферической, палочковидной или извитой формы. Среди бактерий есть небольшое количество нитчатых форм. Бактерии очень малы, диаметр клетки шаровидных бактерий составляет 1 2 мкм. Размножаются бактерии делением (при благоприятных условиях деление происходит через мин). Некоторые бактерии подвижны. Способность двигаться связана с наличием особых органелл жгутиков. Наиболее просты по форме шаровидные бактерии (кокки). Они встречаются или в виде единичных шариков, или шариков, сцепленных между собой. По расположению клеток после деления шаровидные бактерии подразделяют на монококки (единичные кокки), тетракокки (объединены по 4), сарцины (объединены по 8), стафилококки (гроздья), стрептококки (цепочки кокков). 12

13 Палочковидные бактерии представляют собой самую многочисленную группу бактерий. Они имеют цилиндрическую форму клеток с округлыми или заостренными концами и в сильной степени различаются по отношению длины к ширине. Они могут располагаться одиночно либо образуют короткие или длинные цепочки. Палочки могут быть различной длины, обычно несколько мкм, а ширина около 1 мкм. Некоторые палочковидные бактерии образуют внутри клетки особые тельца споры. Каждая клетка образует одну спору, которая служит для перенесения неблагоприятных условий. Спора при соответствующих условиях (температура, влажность, питательные вещества) прорастает, превращаясь в палочку. Стойкость бактериальных спор превосходит стойкость любых живых организмов. Например, спора сенной палочки Bacillus subtilis выдерживает температуру 100 О С в течение 3 ч. Такая устойчивость спор затрудняет борьбу с инфекциями. Извитые микроорганизмы различаются по степени изогнутости клеток и по числу витков. Они разделяются на вибрионы, спириллы и спирохеты. Если у бактерии один неполный завиток спирали, то она называется вибрионом. Если бактерия имеет несколько спиралевидных завитков, то ее называют спириллой, а микробов, имеющих извитую форму с большим количеством мелких завитков, называют спирохетами. Нитчатые бактерии представляют собой нити, состоящие из цилиндрических или дисковидных клеток. Нити некоторых видов заключены в слизистую оболочку, которая может быть пропитана гидроокисью железа или солями марганца. Процесс аккумуляции тяжелых металлов из растворов происходит в клетках некоторых железобактерий. Крупные нитчатые бактерии р. Beggiatoa откладывают в клетках серу. Нитчатые бактерии обитают обычно в морских и пресных водах, встречаются также в разлагающихся органических остатках, в кишечнике животных. К цианобактериям относится большая группа организмов, сочетающих прокариотное строение клетки со способностью осуществлять фотосинтез. Пигменты клеток цианобактерий помимо хлорофилла а (зеленого цвета) содержат фикоцианин пигмент 13

14 синего цвета. По этому признаку раньше их называли синезелеными водорослями. Большинство из них многоклеточные организмы, представляющие собой длинные, чаще всего неразвлетвленные нити (трихомы). Клетки в нитях объединены общей наружной стенкой. Иногда образуют слизистые скопления «маты». Размножение осуществляется путем распада нити на отдельные участки. Некоторые виды передвигаются скольжением (р. Spirulina). Актиномицеты (ветвящиеся бактерии, лучистые грибки) большая группа прокариотных микроорганизмов, которая образует тонкие ветвящиеся нити длиной в несколько мм и диаметром 0,5 1,5 мкм. Они являются своеобразной группой микроорганизмов, которая в морфологическом отношении имеет сходство с плесневыми грибами (рис. 5). Клетки значительной части представителей этой группы способны ветвиться, что является характерным признаком грибов. Однако длина ветвящихся нитей актиномицетов достигает нескольких миллиметров, тогда как длина мицелия грибов нескольких сантиметров. Гифы грибов обычно в несколько раз толще нитей актиномицетов. По морфологии и развитию актиномицеты разделяются на высшие и низшие формы. К высшим относятся организмы с хорошо 14

15 развитым септированным или несептированным мицелием и особыми органами спороношения. Споры образуются в виде цепочек на специальных спороносящих гифах воздушного мицелия. Строение органов спороношения различно у разных видов: длинные или короткие, прямые или спиралевидные (рис. 6). По наличию мицелия и строению органов спороношения высшие актиномицеты напоминают мицелиальные грибы. Некоторые актиномицеты имеют мицелий только в молодой культуре, который с возрастом распадается с образованием палочковидных и кокковидных клеток. Низшие формы актиномицетов не имеют истинного мицелия. Способность к образованию мицелия выражена у них лишь в тенденции клеток к ветвлению. К низшим актиномицетам относятся, например, виды рода Mycobacterium, которые обладают свойством менять форму клеток с возрастом культуры (рис. 7). Это свойство называется плеоморфизм. Среди высших актиномицетов ведущее место по численности в природных средах занимают виды рода Streptomyces. Актиномицеты играют большую роль в процессах 15

16 почвообразования и создания плодородия почв. Актиномицеты разрушают сложные органические соединения (целлюлозу, гумус, хитин, лигнин и др.), недоступные многим другим микроорганизмам. Почти все виды рода Streptomyces образуют специфические продукты жизнедеятельности, обладающие антибиотическими свойствами. Некоторые виды являются возбудителями заболеваний растений, животных и человека. Помимо основных форм бактерий существуют cтебельковые и почкующиеся бактерии, несущие выросты, получившие название простек. (рис.8) 16

17 Функции простек различны. У некоторых бактерий они служат для размножения, у других для прикрепления клетки к субстрату. 17

18 18 Практическая часть Цель работы изучить морфологию представителей бактерий Порядок выполнения работы Выполняя первую работу, студенты учатся обращению с микроскопом, просматривают готовые препараты представителей бактерий, затем самостоятельно готовят препараты живых бактерий и микроскопируют их. Сначала студенты микроскопируют готовые фиксированные препараты бактерий. Фиксированные препараты представляют собой микроорганизмы, суспендированные в водной среде, высушенные на предметном стекле и окрашенные анилиновыми красителями. Препараты некоторых живых микроорганизмов студенты готовят самостоятельно. Для этого на чистое предметное стекло наносится небольшая капля водопроводной воды, в которую прокаленной и остуженной бактериологической петлей вносится небольшое количество исследуемых микробов, тщательно размешивается и накрывается покровным стеклом. Избыток воды снимается фильтровальной бумагой. Препарат помещается на предметный столик и закрепляется зажимами. Сначала, глядя в окуляр и вращая макровинт, добиваются резкого изображения объекта при малом увеличении с объективом 10х. Затем переводят микроскоп на большое увеличение с объективом 40х. Вращение винтов надо производить с осторожностью, так как при слишком резком опускании можно раздавить линзы объективом. При микроскопировании следует иметь в виду, что микроскоп, особенно при больших увеличениях, не захватывает всей глубины объекта, поэтому при постепенном опускании тубуса с помощью микровинта объект виден сначала сверху, а потом в оптическом разрезе. 1. Просмотр фиксированных препаратов микроорганизмов. Lactococcus lactis возбудитель молочнокислого брожения; форма клеток шаровидная кокки; клетки соединены в цепочки. Используется для получения молочнокислых продуктов.

19 Lactobacillus acidophilum палочковидные бактерии; возбудитель молочнокислого брожения. Используется для получения молочнокислых продуктов. Acetobacter aceti палочковидные бактерии, окисляющие этанол в уксусную кислоту. Используется для получения пищевого уксуса. Streptomyces griseus актиномицет, форма клетки в виде тонких разветвленных нитей; продуцент антибиотика стрептомицина. Saccacharopolyspora erythrae актиномицет, форма клетки в виде тонких разветвленных нитей; продуцент антибиотика эритромицина. 2. Просмотр живых препаратов Bacillus subtillis форма клеток в виде тонких подвижных палочек; образует споры; продуцент ферментных препаратов. Spirulina platensis цианобактерия; форма клеток в виде одиночной нити, состоящей из цилиндрических клеток, плотно прилегающих друг к другу; обладает скользящим движением. Применяется в виде пищевой добавки. Содержание отчета 1. Латинское название микроорганизма. 2. Морфология клетки (дать рисунок с указанием увеличения микроскопа и сохраняя соотношение размеров клеток). 3. Использование изучаемых бактерий в промышленности. Контрольные вопросы 1. Опишите устройство микроскопа. 2. Как определить увеличение микроскопа? 3. Какова форма клеток бактерий. 4. Назовите особенности морфологии актиномицетов. 5. Каких представителей бактерий Вы знаете и каково их практическое значение? Работа 2. Морфология эукариотных микроорганизмов Теоретическое введение 19

20 К эукариотным микроорганизмам, которые изучаются микробиологами, относятся: грибы, дрожжи, микроводоросли и некоторые простейшие. Морфология грибов Грибы бесхлорофильные микроорганизмы, имеющие нитевидную форму клеток. Длинные разветвленные нити, образуемые ими, называются гифами. Гифы в совокупности образуют мицелий. По своим размерам гифы грибов намного крупнее актиномицетов. Мицелий у ряда плесневых грибов разделен перегородками (септированный мицелий), а других видов перегородки отсутствуют. В биотехнологии в качестве продуцентов, в основном, используются плесневые грибы. Под названием «плесневые грибы» объединяются некоторые представители фикомицетов, сумчатых и несовершенных грибов. На плотных субстратах плесневые грибы образуют округлые пушистые, паутинообразные, ватоподобные или порошкообразные колонии зеленого, желтоватого, черного или белого цвета. Колонии плесеней состоят из большого количества гифов. Большая часть гифов развивается в воздухе, а часть в толще субстрата. На гифах часто образуются конидиеносцы, на которых споры образуются или внутри спорангия или в виде экзоспор расположенных цепочками. Конидиеспоры, или конидии, служат для бесполого размножения (рис. 10). Конидии, попадая в благоприятные условия, прорастают в мицелий. Плесневые грибы очень широко распространены в природе и имеют мощный ферментативный аппарат. Поэтому они являются основными деструкторами органических соединений в природе. Плесневые грибы также широко используются в промышленности для получения органических кислот, антибиотиков и ферментов. 20

21 Морфология дрожжей Дрожжи представляют собой отдельную группу одноклеточных микроскопических грибов, имеющих большое практическое значение. Дрожжевые клетки представляют собой крупные клетки округлой или овальной формы (рис. 11). Некоторые дрожжи могут образовывать рудиментарный мицелий, который называется «псевдомицелий». Размер клеток колеблется от 3 мкм до 10 мкм в длину и от 2 до 8 мкм в ширину. Большинство дрожжей размножаются почкованием. При этом на 21

22 поверхности клетки появляется небольшая выпуклость почка (иногда не одна, а несколько), постепенно увеличивающаяся в размерах и, наконец, отделяющаяся от производящей ее клетки. Отделившаяся от материнской клетки почка становится новой дрожжевой клеткой. Некоторые дрожжи размножаются делением. В мелкозернистом содержимом живых дрожжей (протоплазме) хорошо заметны крупные вакуоли. Вакуоли представляют собой полости внутри протоплазмы, заполненные клеточным соком. Он состоит из растворенных в воде электролитов, белков, углеводов и ферментов. В молодых дрожжевых клетках протоплазма гомогенная, а на более поздних стадиях развития в протоплазме появляются вакуоли, заполненные клеточным соком с продуктами обмена веществ. При истощении питательной среды у многих дрожжей наступает спорообразование. У некоторых видов дрожжей споры округлой формы и покрыты гладкой оболочкой. В благоприятных условиях споры прорастают. Дрожжи широко распространены в природе. Они встречаются на винограде, на других ягодах и фруктах, в молоке, в воде и почве, а также на коже человека. Многие дрожжи осуществляют спиртовое брожение и применяются для производства спирта в хлебопечении, виноделии, пивоварении. 22 Морфология простейших Простейшие представляют собой одноклеточные организмы животного мира. Среди микроорганизмов они являются наиболее сложно устроенными, имеющими примитивные органы, свойственные многоклеточным животным. У некоторых из них имеются ротовое и анальное отверстия, сократительные и пищеварительные вакуоли. Размножаются простейшие бесполым (делением клетки) и половым путем. Классификация простейших основана на способах движения. 1. Саркодовые. Передвигаются и захватывают пищу с помощью псевдоподий, или ложных ножек. Типичным представителем является Amoeba. Размеры амеб не превышают мкм.

23 2. Жгутиковые. Имеют плотную плазматическую оболочку и передвигаются с помощью жгутиков. Почвенные формы жгутиков очень мелкие (2 5 мкм), а водные крупные (до 20 мкм). Типичным представителем является Euglena. 3. Ресничные. Наиболее высокоорганизованные простейшие. Размеры клеток колеблются от 20 до 80 мкм. Типичным представителем является инфузория-туфелька Paramecium, которую культивируют на корм малькам рыб. 4. Споровики. Неподвижные формы. Многие патогенны, например возбудитель малярии Plasmodium. Простейшие широко распространены в природе. Они встречаются в водоемах, в иле и почве. Значение простейших в природе весьма разнообразно. Они живут в желудочно-кишечном тракте различных животных, принимая участие в переваривании растительной пищи, участвуют в минерализации органических остатков в почве, а также являются важной составляющей частью биоценоза в очистных сооружениях. Питаясь бактериями и взвешенными веществами, они способствуют осветлению воды. Простейшие выполняют функцию индикаторов: по развитию тех или иных форм можно судить о качестве очистки стоков. Так, преобладание амеб и отсутствие в составе активного ила инфузорий свидетельствует о плохой работе очистных сооружений. Инфузория Tetrahymena широко используется для первичной оценки токсичности. Различные виды простейших представлены на рис. 12. Морфология водорослей Водоросли представляют собой обширную группу растительных организмов. Общее для всех них наличие хлорофилла и обусловленное этим фотоавтотрофное питание способность синтезировать органические вещества, используя энергию солнечного света и углекислый газ. У многих водорослей зеленая окраска хлорофилла замаскирована другими пигментами. Среди них встречаются очень мелкие одноклеточные и многоклеточные формы, относимые к микроорганизмам, а также 23

24 многоклеточные организмы, обитающие в морях и океанах и достигающие иногда гигантских размеров.. Объектами изучения микробиологии являются некоторые водоросли микроскопических размеров. Они имеют разнообразную форму и обитают как на суше, так и в водной среде (рис. 13). 24

25 Практическая часть Цель работы изучить морфологию представителей различных групп эукариотов. Порядок выполнения работы Студенты самостоятельно готовят живые препараты представителей грибов, дрожжей, водорослей и простейших; микроскопируют их с объективом х40 и зарисовывают с указанием увеличения микроскопа. Плесневые грибы Aspergillus niger форма клеток в виде мицелия с перегородками; на некоторых гифах имеются неразветвленные конидиеносцы со спорами. Конидиеносцы одноклеточные, шаровидно вздутые, на поверхности вздутия расположены короткие кеглеобразные клетки (стеригмы), каждая из которых отшнуровывает по цепочке конидий, окрашенных в черный цвет. Применяется для получения органических кислот и ферментов. Penicillium chrysogenum гифы имеют перегородки; на некоторых гифах имеются разветвленные конидиеносцы со спорами. Конидии образуются на концах мутовчато разветвленных конидиеносцев. Применяется для получения антибиотика пенициллина. 25

26 Дрожжи Saccharomyces cerevisiae одиночные дрожжи с овальными и округлыми клетками; размножаются почкованием. Применяются в пивоварении, хлебопечении, производстве спирта. В природе встречаются на поверхности ягод и других плодов. Saccharomyces vini форма клеток овальная и округлая; размножаются почкованием; после почкования некоторое время не отделяются, образуя небольшие «веточки». Применяются в виноделии. Rhodotorula glutinis форма клеток эллиптическая; клетки одиночные; размножаются почкованием. Окрашены в оранжевый цвет благодаря содержанию в клетках каротиноидов. Могут расти в средах с углеводородами нефти в качестве источника углерода. Используются как кормовые дрожжи. Candida tropicalis дрожжи с овальными и сильно вытянутыми клетками, образующие «псевдомицелий». Могут расти в минеральной среде с углеводородами в качестве источника углерода. Используются как кормовые дрожжи. В промышленном масштабе выращиваются на отходах производства спирта, бумаги. Водоросли Chlorella vulgaris микроскопическая зеленая водоросль, имеющая округлые клетки (5 10 мкм в диаметре); размножаются автоспорами, которые формируются внутри материнской клетки в количестве от 4 до 32 и освобождаются после разрыва ее оболочки. Могут применяться для массового культивирования с целью получения кормового белка, а также для регенерации воздуха в замкнутых системах (подводные лодки, космические станции и т.д.). Scenedesmus sp. относится к группе зеленых водорослей; имеет овальную форму клеток; наружные клетки часто бывают с заостренными концами; клетки соединены вместе по четыре. Применяется для получения пищевого белка. 26

27 Простейшие Препарат готовится из активного ила аэротенка. Изучить морфологию обнаруженных представителей простейших и зарисовать их. Содержание отчета 4. Латинское название микроорганизма. 5. Морфология клетки (дать рисунок с указанием увеличения микроскопа и сохраняя соотношение размеров клеток). 6. Использование изучаемых микроорганизмов в промышленности. Контрольные вопросы 1. Опишите форму клеток представителей грибов и их практическое использование. 2. Опишите форму клеток дрожжей; назовите представителей, и расскажите об их практическом использовании. 3. Расскажите о морфологии микроводорослей и их практическом использовании. 4. Назовите представителей простейших и расскажите об их применении в биотехнологии. Работа 3. Методы изучения морфологии микроорганизмов Самым распространенным методом изучения морфологии бактерий является микроскопирование фиксированных препаратов, приготовленных из чистых культур микроорганизмов или из исследуемой пробы. Исследование микроорганизмов в живом состоянии применяется при изучении более крупных форм и наблюдении подвижности клеток. Приготовление фиксированных препаратов микроорганизмов Для приготовления фиксированных препаратов микроорганизмов вначале готовят мазок, высушивают его, фиксируют, а затем окрашивают. Мазки готовят на совершенно чистых предметных стеклах. Обезжиривать стекла можно этиловым спиртом, смесью равных объемов спирта и эфира и другими 27

28 жидкостями. Самым простым и практически удобным способом обезжиривания стекол является протирание их с обеих сторон кусочком хозяйственного мыла. Мыло удаляют со стекла кусочком сухой ваты или салфеткой. При изготовлении мазка из колонии бактерий, выращенных на агаризованной среде, вначале наносят на обезжиренное стекло каплю воды или физиологического раствора. Затем прокаливают бактериологическую петлю в пламени горелки. После этого, охладив петлю на внутренней стенке пробирки, захватывают часть колонии без агара петлей. Петлю с культурой вносят в каплю воды или физиологического раствора на стекле и делают 2 3 круговых движения. Часть бактерий суспендируется в жидкости. Избыток бактерий, оставшихся на петле, сжигают в пламени горелки, нагревая петлю докрасна. Затем охлажденной петлей размазывают каплю суспензии по стеклу. Площадь мазка должна быть в диаметре 1,5 2 см. Мазок должен быть тонким с равномерным распределением материала. Если мазок готовят из культуры, выращенной на жидкой питательной среде, то, соблюдая те же правила стерильности, набирают каплю культуры петлей или пипеткой и наносят ее на середину обезжиренного стекла. Пипетку с остатком культуры погружают в сосуд с дезинфицирующим раствором. Каплю равномерно распределяют по стеклу бактериологической петлей. Петлю прожигают в пламени горелки и ставят в штатив или в стакан. Мазок высушивают на воздухе или в струе теплого воздуха, держа его за продольные ребра высоко над пламенем горелки. Границы мазка очерчивают восковым карандашом с обратной стороны стекла, а со стороны мазка на одном из концов стекла ставят номер препарата. По этим отметкам легко можно ориентироваться в месте расположения мазка на стекле. Высушенный мазок фиксируют. Фиксация преследует следующие цели: 1) убить микробов, что делает препарат безопасным при дальнейшей работе; 2) прикрепить микробов к стеклу, чтобы они не смылись при окраске и промывке водой; 3) улучшить восприимчивость красок. 28

29 Наиболее простым, пригодным почти для всех микробиологических объектов и самым распространенным в практике методом является фиксация в пламени горелки. Для этого предметное стекло проводят 3 4 раза через наиболее горячую верхнюю часть пламени горелки, не допуская излишнего перегревания препарата, чтобы не вызвать денатурации белка и нарушения структуры и морфологии бактерий. Различают простые и сложные дифференциальные методы окраски. Простой окраской пользуются для обнаружения в исследуемом материале микробов, определения их количества, формы и расположения. Простая окраска заключается в нанесении на препарат какой-либо одной анилиновой краски. Чаще всего для этих целей употребляется фуксин красная окраска, а также щелочной раствор метиленовой синьки (синька Леффлера) голубая окраска. Техника окраски: хорошо зафиксированный препарат помещают мазком вверх на стеклянный мостик над ванночкой. На поверхность мазка пипеткой или из капельницы наносят одну из указанных красок. Фуксин выдерживают на мазке 1 3 мин, а синьку 3 5 мин. Краску с мазка сливают, препарат промывают водой, высушивают на воздухе или осторожно промокают фильтровальной бумагой. На высушенный мазок наносят каплю иммерсионного масла, помещают препарат на предметный столик микроскопа и микроскопируют с иммерсионным объективом (90) в проходящем свете. Дифференциальные способы окраски бактерий. Сложные методы окраски имеют большое значение при определении и дифференциации различных видов микробов. Они основаны на особенностях физико-химического строения микробной клетки и применяются для детального изучения структуры клетки и выявления отличительных признаков по отношению к некоторым красителям. При этих методах мазок окрашивают несколькими красками и дополнительно обрабатывают протравами или обесцвечивающими веществами спиртом, кислотой и др. К этим методам относят важнейший метод окраски для дифференциации бактерий окраску по Граму. При этом методе выявляется 29

30 способность бактерий удерживать краситель или обесцвечиваться в спирте, что связано с химической структурой клеточной стенки. Все бактерии по строению клеточной стенки делятся на две группы: 1) красящиеся по Граму грамположительные и 2) не красящиеся по Граму грамотрицательные. Отношение к окраске по Граму является настолько важным дифференциальным признаком бактерий, что обязательно упоминается при их характеристике и служит таксономическим признаком. 30 Методика окраски по Граму На фиксированный мазок кладут полоску фильтровальной бумаги, заранее пропитанной генцианвиолетом. На полоску наносят 3 5 капель водопроводной воды. Через 1 2 мин бумажку удаляют пинцетом, а на препарат наливают раствор Люголя. Через 30 сек 1 мин сливают раствор Люголя. Наносят несколько капель 96 О -ного спирта. Обесцвечивают в течение 1 мин до исчезновения сероватофиолетовых струек. Препарат промывают водой. На мазок наливают фуксин и выдерживают 1 2 мин. Краску сливают, препарат промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой. Микроскопируют с иммерсионной системой. Грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетово-синий (например, палочка маслянокислого брожения Clostridium pasteurianum), а грамотрицательные в розово-красный цвет (кишечная палочка Escherichia сoli). Кроме этой традиционной методики окрашивания по Граму имеется быстрый и простой метод для дифференциации по Граму без окрашивания. Клетки бактерий (лучше 1 2-суточные) помещают петлей в каплю 3%-ного KOH на предметное стекло, размешивают круговыми движениями и через 5 8 с петлю резко поднимают. Суспензия грамотрицательных бактерий становится вязкой и тянется за петлей, образуя слизистые тяжи. Грамположительные бактерии равномерно распределяются в капле щелочи (как в воде). Реакция считается отрицательной, если образования слизистых тяжей не наблюдается в течение 60 с. Увеличение вязкости вызвано лизисом клеточных стенок грамотрицательных бактерий в растворе

31 щелочи и освобождением ДНК. Метод дифференциации бактерий по Граму без окрашивания следует использовать лишь для предварительной диагностики, либо подсчета примерного соотношения колоний грамположительных и грамотрицательных бактерий. Выявление живых и мертвых клеток методом окраски метиленовой синью Число живых и мертвых клеток можно определить методом окраски раствором метиленовой сини. Метод основан на различной проницаемости живых и мертвых клеток микроорганизмов. Клеточная проницаемость у мертвых клеток нарушается, поэтому краситель свободно проходит сквозь цитоплазматическую мембрану и адсорбируется протоплазмой. Под микроскопом мертвые клетки выглядят синими, живые бесцветными или бледноголубыми. Окраска осуществляется следующим образом: на предметное стекло наносится капля 2% раствора метиленовой сини, покрывается покровным стеклом, избыток краски оттягивается кусочком фильтровальной бумаги. Препарат просматривается под микроскопом, в 10 полях зрения считают количество живых и мертвых клеток; число мертвых клеток выражается в %. Пример: среднее число живых клеток в одном поле зрения 10, среднее число мертвых клеток в одном поле зрения 5, общее число клеток в одном поле зрения клеток 100% 5 клеток Х Х 33,3% 15 Таким образом, число мертвых клеток в исследуемой суспензии микроорганизмов составило 33,3%. Определение размеров клеток Для определения размеров клеток микроорганизмов необходимо иметь специальный окуляр со шкалой (окулярный микрометр) и объект-микрометр. Окулярный микрометр, в 31

32 простейшем случае, представляет собой стеклянный диск с нанесенной на нем линейной шкалой, который вкладывается в окуляр (рис. 14а). Объект-микрометр представляет собой предметное стекло, в центре которого выгравирована линейная шкала длиной 1 мм, с ценой деления 10 мкм. Перед измерением необходимо определить цену деления окулярного микрометра для каждого увеличения микроскопа. Для этого объект-микрометр помещается на предметный столик микроскопа и рассматривается как препарат; при этом одно из видимых делений объект-микрометра совмещается с нулевой отметкой шкалы окулярного микрометра и отмечается совпадение делений той и другой шкалы (рис. 15). Подсчитывают, сколько окулярных и объективных делений приходится на этот отрезок, и вычисляют цену делений окулярного микрометра. Если после этого поместить на предметный столик препарат микроорганизмов вместо объект-микрометра и рассматривать его 32

33 при том же увеличении, то можно измерить величину микробной клетки, пользуясь шкалой окулярного микрометра как линейкой. Для точных измерений применяется специальный окулярный микрометр со скользящей нулевой отметкой, связанной с измерительным барабаном (рис. 14б). Он позволяет определить размеры микроорганизмов с точностью до десятых долей микрона. Нулевой отметкой служит двойная вертикальная линия, середина которой соответствует пересечению двух тонких линий в виде креста. Перед измерениями необходимо узнать цену деления шкалы измерительного барабана. Эталоном служит объект-микрометр. Вращая измерительный барабан, нулевой отметкой обводят несколько делений шкалы объект-микрометра. Двойная вертикальная линия показывает число полных оборотов измерительного барабана. Проводя измерения микроорганизмов, передвигают нулевую отметку вдоль объекта и считают показания измерительного барабана. Практическая часть Цель работы освоить основные методы изучения морфологии микроорганизмов. 33

34 Порядок выполнения работы 1. Приготовить фиксированные препараты молочнокислых бактерий из биокефира и ацидофилина. 2. Выполнить окраску по Граму клеток Bacillus subtilis (грам+) и Escherichia coli (грам-). 3. Определить размеры дрожжевых клеток Saccharomyces cerevisiae. 4. Определить число живых и мертвых клеток Saccharomyces cerevisiae в суспензии дрожжей. 34 Содержание отчета 1. Морфология клеток молочнокислых бактерий (рисунки фиксированных препаратов молочнокислых бактерий с указанием увеличения микроскопа). 2. Рисунки фиксированных препаратов грамотрицательных и грамположительных бактерий. 3. Определение цены деления измерительного барабана окулярного микрометра. 4. Размеры дрожжевой клетки Saccharomyces cerevisiae. 5. Число живых и мертвых клеток в суспензии дрожжей. Контрольные вопросы 1. Как приготовить фиксированный препарат бактерий? 2. С чем связано различие бактерий в окраске по Граму? 3. В чем заключается метод окраски по Граму? 4. Как определить размер микроорганизмов? 5. Как определить количество живых и мертвых клеток микроорганизмов методом окраски метиленовой синью? Тема 2. Культивирование микроорганизмов: принципы составления питательных сред; методы стерилизации; методы посевов и пересевов микроорганизмов. Классификация и приготовление питательных сред Культивировать микроорганизмы это значит искусственно создавать условия для их роста. Для культивирования

35 микроорганизмов в лаборатории или в промышленности применяются питательные среды, содержащие все необходимые для жизнедеятельности микроорганизмов вещества. Из окружающей среды питательные вещества поступают в клетку микроорганизма, а из клетки в среду выводятся продукты обмена. Для жизнедеятельности микроорганизмов необходимы вода, углерод, кислород, азот, сера, фосфор, калий, кальций, магний, железо и микроэлементы. Все эти вещества должны содержаться в питательной среде. Даже без одного из них роста или совсем не будет или он будет ничтожным. Углерод, водород, азот, фосфор и сера называются биогенными элементами, так как на их долю приходится около 90 95% сухой массы клеток. Калий, магний, кальций и натрий называются макроэлементами, или зольными элементами. На их долю приходится до 5 10% сухой массы клеток. Железо, марганец, молибден, кобальт, медь, ванадий, цинк, никель и некоторые другие катионы тяжелых металлов называются микроэлементами и составляют доли процента сухой массы клеток. Наибольшее значение для любого живого организма имеет углерод. Он входит в состав всех органических молекул в клетке и на его долю приходится около 50% сухой биомассы. По отношению к углероду все организмы делятся на автотрофные и гетеротрофные. Автотрофы в качестве источника углерода используют углекислый газ. Гетеротрофы нуждаются в готовых органических соединениях. Источником углерода для большей части микроорганизмов могут служить различные органические вещества: белки и продукты их распада, углеводы, жиры, углеводороды. Азотное питание по своему значению стоит на втором месте после углеродного. Азот входит в состав аминокислот и других клеточных компонентов, которые обеспечивают жизнеспособность организмов. Азот составляет 14% от сухого вещества клеток. Источником азота служат азотсодержащие органические или минеральные соединения. Источниками минерального азота чаще всего являются соли аммония и нитраты. В качестве органических источников азота используются белки, аминокислоты, нуклеотиды. Некоторые прокариоты могут использовать атмосферный азот. 35

36 Фосфор и сера входят в состав важных биополимеров клетки. Фосфор (3% сухого вещества клеток) входит в состав нуклеотидов и АТФ, а сера (менее 1%) в состав некоторых аминокислот. В качестве источника фосфора обычно используют фосфаты, а серы сульфаты. Фосфор и сера могут также использоваться в виде органических соединений. Для роста микроорганизмов требуются в небольших количествах макроэлементы: ионы щелочных металлов (Na +, K +) и щелочноземельных металлов (Mg 2+, Ca 2+), которые играют важную роль в жизнедеятельности микроорганизмов. Макроэлементы в клетках микробов необходимы для регулирования проницаемости, осмотического давления, величины рн. Помимо этих металлов, для роста микробов необходим ряд элементов в следовых количествах (микроэлементы). Минеральный состав питательной среды формирует распределение электрических зарядов на поверхности клетки. Изменение электрического потенциала клеток может изменить их физиологическую деятельность. Одна из основных функций микроэлементов участие в ферментативном катализе. В настоящее время действие четвертой части всех ферментов в клетке связывают с металлами. Кроме основных компонентов питательной среды для нормального развития некоторых микробов необходимы еще добавочные вещества, которые носят название «факторов роста». Факторы роста это объединенное название различных по химической природе соединений. Главным образом это органические вещества, добавление которых в очень незначительных количествах стимулирует рост и размножение микроорганизмов. Они имеют для микробов то же значение, что витамины для высших организмов. Ростовыми факторами в основном являются витамины группы В, которые играют роль регуляторов и стимуляторов обмена веществ у микробов, или аминокислоты. В качестве факторов роста используют дрожжевой автолизат, дрожжевой экстракт, нативные белки (кровь, сыворотка) и др. Потребности в источниках питания микроорганизмов весьма разнообразны. По этой причине не существует универсальной 36

37 среды, одинаково пригодной для культивирования любого микроорганизма. В зависимости от целей культивирования и потребностей данного микроорганизма питательные среды различаются по трем признакам: по составу, физическому состоянию и назначению. По составу питательные среды подразделяются на две группы: 1) естественные (натуральные); 2) искусственные (синтетические). Естественными называются среды, имеющие неопределенный химический состав, так как в них входят продукты растительного или животного происхождения, отходы различных производств, содержащие органические соединения. Естественные питательные среды обеспечивают интенсивный рост самых разнообразных микроорганизмов. Они содержат богатый набор органических и неорганических соединений, в том числе все необходимые элементы и дополнительные вещества. Например, в лабораторных условиях чаще всего используются следующие питательные среды. 1. Мясо-пептонный бульон (МПБ) экстракт из мяса, содержит продукты неполного распада белка пептоны, в которых имеется органический углерод, органический азот, фосфорсодержащие, серосодержащие органические вещества. В МПБ содержатся также все необходимые микроорганизмам минеральные вещества. МПБ применяется при выращивании многих видов бактерий. 2. Пивное сусло экстракт из проросших зерен ячменя, содержит в качестве источника углерода сахара (в основном мальтозу), азотистые вещества, зольные элементы, различные ростовые факторы и витамины группы В. Пивное сусло является хорошей средой для развития многих микроорганизмов, в частности дрожжей, плесневых грибов. Хорошими естественными средами являются молоко, картофель, отвары из плодов и овощей. В промышленности обычно применяют полусинтетические или естественные среды. Очень часто в качестве источника углерода используют отходы микробиологической или пищевой промышленности: меласса (отход сахарного производства), 37

Министерство сельского хозяйства Российской федерации ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНСТВО ПО РЫБОЛОВСТВУ КАМЧАТСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ КАФЕДРА БИОЛОГИИ И ХИМИИ ХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ ВОДЫ ПРИГОТОВЛЕНИЕ

Фамилия Шифр Имя Рабочее место Район Шифр Итого: Задания практического тура регионального этапа XXXII Всероссийской. БИОХИМИЯ. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЭКСТРАКТОВ Оборудование: Пробирки (3 пробирки с экстрактами

Фамилия Шифр Имя Район/город Рабочее место Шифр Итого: ЗАДАНИЯ практического тура регионального этапа XXVIII Всероссийской олимпиады школьников по биологии. 2011-12 уч. год. 11 класс БИОХИМИЯ. Оборудование,

МИКРОБИОЛОГИЯ ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА К РАБОЧЕЙ ПРОГРАММЕ КУРСА «Микробиология», 9 класс» на основе авторской программы элективного курса «Микробиология» Аверчинковой О.Е Биология. Элективные курсы. Лечебное

ЗАДАНИЯ МИКРОБИОЛОГИЯ (мах. 20 баллов) Цель работы: Приготовить и проанализировать препараты из двух известных кисломолочных продуктов. Оборудование: Микроскопы, горелки или спиртовки, предметные стекла,

ЦАРСТВО ПРОКАРИОТЫ ПОДЦАРСТВО БАКТЕРИИ Бактерии относятся к прокариотам. Это самые простые, наиболее мелкие и широко распространенные организмы, которые существуют на земле более 2 млрд. лет, но вместе

СИСтЕМа ОРГаНИчЕСКОГО МИРа Все существующие на Земле организмы разделены на четыре царства: Дробянки, Грибы, Растения, Животные. Дробянки относятся к прокариотам (доядерным организмам), грибы, растения,

Тема проекта Исследование микроорганизмов, обитающих в стоячем водоеме Бутовского леса города Москвы Автор(ы): Касаева Диана, Касаева Кристина, Ткаченко Алиса Школа: ГБОУ СОШ 1945 Класс: 5 класс Руководитель:

Лабораторная работа «Строение тел шляпочных грибов» Цель: изучить строение тел шляпочных грибов Оборудование: шляпочные грибы (белый гриб, сыроежка, шампиньон, подберезовик, масленок, опенок и др.), готовые

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ОМСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ П.А.СТОЛЫПИНА» ИНСТИТУТ ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ И БИОТЕХНОЛОГИИ

Утверждаю Заместитель Главного государственного санитарного врача Российской Федерации - Главный врач Федерального центра госсанэпиднадзора Минздрава России Е.Н.БЕЛЯЕВ 20 февраля 2004 г. N 24ФЦ/900 Дата

Исследовательская работа Дрожжи: захватывающая жизнь маленьких грибов Автор работы: учащийся 5 «Б» класса ГБОУ Гимназия 1748 «Вертикаль» Кутайцев Георгий Валерьевич Руководитель: Носова Елена Владимировна,

Метод выявления дрожжей и плесневых грибов в пищевых продуктах МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Методы выявления дрожжей и плесневых грибов в пищевых продуктах.: Методические рекомендации.- М.: Федеральный центр

Тема 4. Бактерии. Грибы. Лишайники. Часть А. 1. Наличие в составе лишайника цианобактерий обеспечивает 1) поглощение атмосферной и почвенной влаги 2) использование света для образования питательных веществ

БИОЛОГИЯ НАУКА О ЖИВой ПРИРОДе Биология изучает: ЧТО ИЗУЧАЕТ БИОЛОГИЯ z строение и жизнедеятельность живых организмов; z законы индивидуального и исторического развития организмов. 3 СИСТЕМА ОРГАНИЧЕСКОГО

1. Нитрифицирующие бактерии относят к 1) хемотрофам 2) фототрофам 3) сапротрофам 4) гетеротрофам ТЕМА «Фотосинтез» 2. Энергия солнечного света преобразуется в химическую энергию в клетках 1) фототрофов

МИКРОБИОЛОГИЯ И ГЕНЕТИКА Задание 1. Приготовить и проанализировать препараты из двух известных кисломолочных продуктов. (мах.10 баллов) Оборудование: Микроскопы, горелки или спиртовки, предметные стекла,

Квалификационные тесты по специальности «Бактериология» Банк тестовых заданий для подготовки к аттестации Выбрать один или несколько правильных ответов 1. В соответствии с приказом ГКСЭН РФ N обязательная

Задания 3. Одноклеточные и многоклеточные организмы. Царство грибы 1. Что содержится в чёрных шариках на концах длинных ответвлений у гриба мукора? 1) микроскопические плоды 2) питательные вещества 3)

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ «ОРЕНБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» Методические рекомендации для самостоятельной работы обучающихся

Морфология микроорганизмов Вариант 1 1. Gracilicutes - это: А. тонкостеночные бактерии Б. толстостеночные бактерии В. бактерии с дефктной клеточной стенкой. Г. бактерии с нежной клеточной стенкой. 2. К

Задание для студентов: необходимо выбрать правильные ответы (может быть от одного до нескольких). Морфология микроорганизмов Вариант 1 1. Gracilicutes - это: А. тонкостеночные бактерии Б. толстостеночные

Водоросли Водоросли низшие растения Водоросли обширная и неоднородная группа низших растений. Водоросли самые многочисленные и одни из самых важных для планеты фотосинтезирующих организмов. Они встречаются

Муниципальное бюджетное общеобразовательное учреждение Аларская средняя общеобразовательная школа «Рассмотрено» Руководитель МО Протокол от 0 г. «Согласовано» Заместитель директора по УВР МБОУ 0 г «Утверждаю»

1 Основные приемы работы с микроорганизмами Задача 1. Введение в микробиологию.техника безопасности при работе с микроорганизмами Цель задачи. Эта задача познакомит вас с правилами безопасной работы в

Задания 2. Клеточное строение организмов 1. Какой химический элемент входит в состав жизненно важных органических соединений клетки? 1) фтор 2) углерод 3) медь 4) калий 2. В качестве запасающего вещества

Плесневые грибы влияние физических факторов на рост и развитие грибов. Логунов Степан 7г Руководитель проекта Булычева М.Б. Актуальность исследования Споры грибов отличаются высокой устойчивостью к неблагоприятным

Тест 5 Вариант 1. Тема «Грибы» Задания с выбором одного верного ответа. 1. Главное отличие грибов от растений состоит в том, что они: имеют клеточное строение, поглощают из почвы воду и минеральные соли,

1. Пояснительная записка Программа предназначена для поступающих в аспирантуру ФГБОУ ВПО БГУ по специальности 03.02.03 - Микробиология Программа подготовки высококвалифицированных специалистов по направлению

ОБЩАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ
Глава I. Микроскоп и техника микроскопиропания
1. Светооптическая микроскопия
2. Микроскопия в темном поле
3. Фазово-контрастная микроскопия
4. Люминесцентная (флуоресцентная) микроскопия
Глава II. Общие представления о культивировании, технике посева и необходимом оборудовании для работы с микроорганизмами
Глава III. Методы приготовления препаратов микроорганизмов
Глава IV. Исследование микробной клетки
1. Формы клеток микроорганизмов
2. Строение клеток микроорганизмов (цитохимические методы исследования)
3. Окраска клеток микроорганизмов по Граму
4. Окраска спор у бактерий
5. Окраска капсул
6. Окраска жгутиков
7. Окраска ядерного вещества бактерий
8. Окраска включений клеток микроорганизмов
Глава V. Питание микроорганизмов
1. Значение отдельных питательных элементов
2. Приготовление питательных сред
3. Методы стерилизации
Глава VI. Учет численности бактерий и выделение чистой культуры
1. Учет численности бактерий в почве
2. Определение качественного состава бактерий
3. Учет численности микроорганизмов в воде и других жидкостях
4. Учет численности бактерий в воздухе
5. Выделение чистых культур бактерий
Глава VII. Определение вида бактерий
Глава VIII. Превращение микроорганизмами безазотистых органических веществ
Процессы брожения
1. Спиртовое брожение
2. Молочнокислое брожение
3. Маслянокислое брожение
4. Брожение пектиновых веществ
5. Брожение целлюлозы
6. Окисление клетчатки
7. Окисление жира
8. Окисление углеводородов
Глава IX. Превращение микроорганизмами органических и минеральных соединений азота
1. Аммонификация
2. Нитрификация
3. Денитрификация (нитратное дыхание)
4. Биологическая фиксация атмосферного азота
Глава X. Превращение микроорганизмами соединений серы, железа и фосфора
1. Превращение микроорганизмами соединений серы
2. Участие микроорганизмов в превращении железа
3. Превращение микроорганизмами соединений фосфора
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ
Глава XI. Общий микробиологический анализ почвы
1. Методы исследований
2. Группы микроорганизмов, состав и приготовление питательных сред
3. Взятие средней почвенной пробы и подготовка образца к микробиологическому анализу
4. Приготовление почвенной суспензии
5. Учет различных групп микроорганизмов
6. Определение общего количества микроорганизмов в почве методом прямого счета под микроскопом
Глава XII. Изучение ценозов микроорганизмов
1. Метод обрастания стекол по Н. Г. Холодному
2. Изучение микробных ценозов в почве по методу Перфильева и Габе
3. Метод капилляров Перфильева в модификации Аристовской
4. Выявление микроорганизмов автохтонной группы, участвующей в разложении гумусовых веществ, по методу Виноградского в модификации Теппер
5. Выявление микроорганизмов, участвующих в разложении гумусовых веществ, по методу Теппер
Глава XIII. Определение биологической активности почвы
1. Определение биологической активности почвы по интенсивности разложения полотна (метод Мишустина, Вострова и Петровой)
2. Определение общей микробиологической активности почвы по выделению углекислого газа
3. Определение аммонифицирующей активности почвы
4. Определение аммонифицирующей активности микроорганизмов
5. Определение нитрифицирующей активности почвы
6. Определение денитрифицирующей активности почвы
7. Определение азотфиксирующей активности микроорганизмов
Глава XIV. Изучение бактерий корневой зоны растений и на корнях
1. Учет бактерий в ризосфере методом Красильникова
2. Учет ризосферной и корневой микрофлоры методом последовательных отмываний корней по Е. 3. Теппер
3. Выделение чистых культур клубеньковых бактерий, количественный учет в почве, определение их активности и вирулентности
Глава XV. Анализ бактериальных препаратов
Глава XVI. Микробиология кормов
1. Эпифитная микрофлора зерна и ее изменение при хранении корма
2. Анализ силоса
3. Дрожжевание корма
Глава XVII. Микрофлора молока и молочных продуктов
1. Бактериологический анализ молока
2. Методы выделения молочнокислых бактерий в чистую культуру
3. Знакомство с микрофлорой сливочного масла
Указатель литературы